IF: 27+ 基于单细胞测序揭示以 ZEB1 转录因子为主要调节因子的衰老细胞群促进软骨和半月板骨关节炎...-CSDN博客

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公司英文名称：Kyoho Gene Technology (Beijing) Co.,Ltd.

这期分享一篇2022年发表在2023年3月发表于 Annals of the Rheumatic Diseases（IF27.4），作者基于单细胞测序揭示衰老细胞群促进软骨和半月板骨关节炎。该文章使用桓峰基因公众号里面生信分享教程即可实现，有需要类似思路的老师可以联系我们！

摘要

目的：对正常人和骨关节炎(OA)膝关节的关节软骨和半月板组织进行单细胞水平分析。

方法：对健康膝关节(n=6, n=7)和OA膝关节(n=6, n=6)的关节软骨和半月板组织进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析。使用免疫组织化学和RNA-seq验证感兴趣基因的表达，并通过基因过表达和缺失分析功能。

结果: 人膝关节软骨(70972个细胞)和半月板(78017个细胞)的scRNA-seq分析鉴定出两个组织共享的致病亚群。这种细胞群在OA中扩增，具有很强的OA和衰老基因特征。此外，该亚群在细胞外基质(ECM)和腱素信号传导中起关键作用，是所有其他软骨和半月板簇的主要信号发送者和TGFβ信号的接收器。成纤维细胞激活蛋白(FAP)也是该簇中一个失调的基因，并促进ECM降解。由转录因子ZEB1控制的规则在关节软骨和半月板的致病亚群中是共享的。在半月板和软骨细胞中，FAP和ZEB1促进OA发病机制的基因表达，包括衰老。

结论：这些单细胞研究发现，在软骨和半月板中存在一种衰老的致病细胞群，FAP和ZEB1是这两种组织中OA相关途径的新的和有希望的治疗靶点。

生信分析流程

相关数据集选择：

健康膝关节(n=6, n=7)和OA膝关节(n=6, n=6)的关节软骨和半月板组织进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)

基因集选择

免疫组织化学和RNA-seq验证感兴趣基因的表达

生信分析方法：

根据文章的分析流程提取所有的分析内容，整理出来就 11个分析条目，每个条目都包括分析的内容，这些分析构成了整个文章，本文属于单细胞测序生信分析类文章，下面我们就看看哪些分析可以利用桓峰基因公众号的教程来实现，点击分析条码就会跳转到对应公众号的教程，跟着教程做，您也能发轻松发高分，如下：

1. 单细胞数据比对（CellRanger V2.1.1)

2. 单细胞数据指控，聚类，差异分析等（Seurat V4.0.6）

3. 基因功能富集分析（ gProfiler）

4. 单细胞数据进行差异丰度测试(miloR)

5. 细胞间配体-受体相互作用（CellChat）

6. 转录因子调控分析（SCENIC）

7. 转录因子活动分析及确定活动调节子（AUCell）

8. 绘制条形图（Barplot）

9. 绘制小提琴图（ViolinPlot)

10. 绘制箱线图（BoxPlot）

11. 多组比较分析统计（ANOVA）

研究结果

1. 健康人关节软骨单细胞RNA测序

(A) 健康关节软骨样本的均匀流形近似和投影(UMAP)图聚类可视化。

(B) 单个供体对每个群集的贡献的量化，显示为综合数据集总细胞计数的百分比。

(D) CellChat分析用于询问关节软骨簇之间的细胞-细胞通信模式。

(E) 通过热图显示关节软骨簇上所有富集信号(传出和传入)的相对强度。

(F) pySCENIC分析显示，在所有健康的关节软骨簇中，富集的调控子(TF和所有启动子结合的基因靶标)。

(G - I) 显示FC-1 (G)、FC-2 (H)和HTC (I)中活性调控(AUC <1)的热图。

(J) FC-1、FC-2和HTC之间活性调控的交集。

2. 健康人半月板单细胞RNA测序

(A) 健康半月板样本UMAP图聚类可视化。

(B) 单个供体对每个群集的贡献的量化，显示为综合数据集总细胞计数的百分比。

(D) CellChat分析用于询问关节软骨簇之间的细胞-细胞通信模式。

(E) 在热图中显示了半月板群上所有富集信号(输出和传入)的相对强度。

(F) pySCENIC分析显示，在所有健康的半月板群中富集的调控子(TF和所有启动子结合的基因靶标)。

3. OA关节软骨致病性群体的鉴定

(A) 正常(n=6)和OA (n=6)关节软骨样本的统一流形逼近和投影(UMAP)图聚类可视化。

(B) 通过不同情况(正常与OA)的UMAP图可视化识别OA软骨的致病群体(黑箱)。

(C, D) Milo分析显示，在致病性亚群中，OA与正常(蓝框)相比，细胞邻域的丰度存在差异。

(E) 将OA基因签名分数分配给集成数据集中的每个细胞，并将分数可视化到按聚类划分的小提琴图上。

(F) UMAP图显示致病亚群中POSTN的显著表达。

(G) 气泡图显示了按条件划分的所有集群中衰老基因(核心、相关和SASP)的表达。

(H, I) GO分析显示，使用gProfiler在致病性亚群中生物过程下调(H)和上调(I)。

4. OA半月板致病群体的鉴定

(A) 综合正常(n=7)和OA (n=6)半月板样本的UMAP图聚类可视化。

(B) 通过不同情况(正常vs OA)的UMAP图的可视化，鉴定OA半月板的致病群体(黑盒子)。

(C, D) Milo分析显示，在致病性亚群中，OA与正常(蓝框)相比，细胞邻域的丰度存在差异。

(E) 将OA基因签名分数分配给集成数据集中的每个细胞，并将分数可视化到按聚类划分的小提琴图上。

(F) UMAP图显示致病亚群中POSTN的显著表达。

(G) 气泡图显示了按条件划分的所有集群中衰老基因(核心、相关和SASP)的表达。

(H, I) GO分析显示，使用gProfiler在致病性亚群中生物过程下调(H)和上调(I)。

5. FAP促进OA发病基因，包括MMP9和IL6

(A) 小提琴图显示OA中FAP表达上调，与所有簇(上)的正常相比，特别是在关节软骨的致病簇(下)。

(B, C) 骨性关节炎与正常关节软骨的免疫组化和FAP蛋白定量。

(D) 小提琴图显示，与半月板中所有集群(上)和致病集群(下)相比，OA中FAP表达上调。

(E, F) 半月板OA与正常半月板的免疫组化及FAP蛋白定量。

(G) 与载体对照细胞(n=3)相比，在FAP激活的TC28a2细胞(n=3)中，DESeq2正常化了FAP的读取计数。

(H) 火山图显示，与对照细胞相比，fap激活的TC28a2细胞中基因显著下调(蓝色)和上调(红色)。

(I,J) 氧化石墨烯分析显示FAP激活的生物过程下调(I)和上调(J)。

(K) RT-qPCR显示，与载体对照相比，fap激活的TC28a2细胞中ACAN、COL2A1、MMP2、MMP9和IL6的表达。

(L) 利用shRNA在fap缺失的TC28a2细胞中进行RT-qPCR。

(M - P) fap激活的原代健康关节软骨(M)、健康半月板细胞(O)、OA关节软骨细胞(N)和OA半月板细胞(P)中(K)的RT-qPCR

6. 致病性亚群是OA关节软骨和半月板中胶原、TGFβ和腱素信号传导的关键调节因子

(A, I) 关节软骨(A)和半月板(I)中所有簇簇之间发生的信号相互作用的数量。

(B, J) 散点图中显示的关节软骨(B)和半月板(J)中每个簇簇的总体进出信号强度。

(C, K) 通过热图显示的关节软骨(C)和半月板(K)群的所有富集信号(进出)的相对强度。

(D) 四个CellChat中心性度量(S:发送者，R:接收者，M:调解者和I:影响者)中每个集群的角色重要性的尺度。

(E, F, G, L, M, N) 圆形图显示了关节软骨(E, F, G)和半月板(L, M, N)所有簇中胶原(E, L)、TGFβ (F, M)和腱素(G, N)信号通路中四个中心性测量的方向和热图的重要性。

(H, O) 关节软骨(H)和半月板(O)中“腱素”信号网络组成的每个L- r信号相互作用的重要性。

7. 在两种组织类型的致病性亚群中共同的失调TF的鉴定。

(A, B) pySCENIC分析显示，在关节软骨(102条)和半月板(72条)的致病亚群中，富集的调控子(AUC<0.5)。

8. ZEB1促进线粒体失调和p16诱导的细胞衰老

(A) 小提琴图显示OA中ZEB1表达上调，与所有簇(左)和关节软骨中致病簇(右)的正常表达相比。

(B, C) 骨性关节炎与正常关节软骨的免疫组化和ZEB1蛋白定量。

(D) 小提琴图显示，与半月板中所有簇(左)和致病簇(右)相比，OA中ZEB1表达上调。

(E) 与载体对照细胞(n=3)相比，ZEB1激活的TC28a2细胞(n=3)中DESeq2正常化的ZEB1读取计数。

(F) 火山图显示，与对照细胞相比，zeb1激活的TC28a2细胞中基因显著下调(蓝色)和上调(红色)。

(G,H) 条形图分析显示，使用gProfiler进行ZEB1激活的生物过程下调(G)和上调(H)。

(I) RT-qPCR显示，与载体对照相比，ZEB1激活的TC28A2细胞中CDKN1A、CDKN2A、RELA、MMP2、MMP9、IL6和SERPINE1的表达。

(J, K) 使用shRNA (J)和CRISPRi (K)在zeb1缺失的TC28a2细胞中进行RT-qPCR (I)。

(L, M) 在zeb1激活的原代关节软骨(L)和原代半月板(M)细胞中进行RT-qPCR (I)。

Reference:

Swahn H, Li K, Duffy T, et al. Senescent cell population with ZEB1 transcription factor as its main regulator promotes osteoarthritis in cartilage and meniscus. Annals of the Rheumatic Diseases 2023;82:403-415.