Science:神经元活动的高时空分辨率在体直接成像

长期以来，对非侵入性神经成像方法的需求一直存在，这种方法可以在高时间和高空间分辨率下检测神经元活动。我们提出了一种二维快速线扫描方法，能够以毫秒精度直接成像神经元活动，同时保留磁共振成像(MRI)的高空间分辨率。在电须垫刺激期间，这种方法通过9.4特斯拉的活体小鼠大脑成像得到了证明。体内峰值记录和光遗传学证实了所观察到的MRI信号与神经活动的高度相关性。它还捕获了沿着丘脑皮层通路的神经元活动的顺序和层状特异性传播。这种对神经元活动的高分辨率、直接成像将通过提供对大脑功能组织(包括神经网络的时空动力学)的更深入理解，为脑科学开辟新的途径。

先进的非侵入性神经成像方法提供了关于大脑功能组织的有价值的信息，但它们在时间和空间分辨率方面有明显的优点和缺点。功能磁共振成像(fMRI)使用血液氧合水平依赖(BOLD)效应提供了毫米级的空间分辨率。然而，它的时间分辨率受到对神经元活动(如尖峰)的缓慢血流动力学响应的限制，而最近在亚秒振荡神经元动力学成像方面取得了进展。由于BOLD信号和尖峰活动之间没有直接对应关系，BOLD- fmri提供了关于神经元活动的间接信息，本质上限制了空间和时间精度。脑电图(EEG)和脑磁图(MEG)在毫秒范围内提供了出色的时间分辨率，但空间信息仅限于厘米尺度。因此，在利用MRI的高空间分辨率的同时，将基于MRI的时间分辨率提高到EEG或MEG的毫秒量级，对于促进对活体大脑的理解是必要的。

许多人尝试使用MRI直接成像神经元活动。其中大多数是基于神经元电流模型，其中神经元电流沿轴突流动产生一个纳特斯拉(nT)量级的超弱周向磁场，从而局部改变磁共振(MR)信号的相位和幅度。幻影研究表明，当注入电流通过凝胶幻影中的电线时，磁场变化1nt引起了小的相移(<1°)。使用无血红蛋白生物物体的体外研究也报告了应用刺激诱导的MR信号幅度的变化(例如，0.01至5.5%)。一些研究认为，他们成功地直接检测了体内的人脑激活，但这些结果在后来的尝试中没有得到重复。

其他的尝试也已经做出在细胞水平使用生物物理变化或使用造影剂直接测量神经元活动。在扩散fMRI中，微结构变化，如细胞肿胀，可能导致水扩散的变化，已被提出作为直接测量神经元活动的可能信号源。尽管最初的结果受到质疑，但最近的工作显示了令人鼓舞的证据，即弥散性fMRI在血流动力学反应的基础上比传统fMRI提供了更快、更具体的神经元活动检测。另一种方法是开发造影剂，如锰，能够在啮齿动物体内测量细胞内钙，但受到毒性和诱导的生理效应的限制，特别是在人体研究中。

我们提出了一种用于功能性MRI的神经元活动直接成像(以下称为DIANA)的方法。有了DIANA，时间分辨率提高到以毫秒为单位的神经元活动的时间精度，同时保留了MRI的高空间分辨率的原始好处。

1.结果
1.1 毫秒时间分辨率水平的神经元活动的MRI
为了实现毫秒级的高时间分辨率，我们使用了传统的二维(2D)梯度回波成像序列，通过结合线扫描采集策略，具有几毫秒的短回波时间(TE)和短重复时间(TR)，这将被称为2D快速线扫描，其中在每个刺激间隔期间重复获取单行k-空间，在不同的时间段获取不同的k-空间线。每个刺激周期为该周期内的所有时间序列图像增加一条k空间(图1A)，而TR恰好决定了动态成像的时间分辨率。这可以通过简单地交换2D梯度回波成像序列中的重复和相位编码循环的顺序来实现。电刺激以200毫秒的刺激间隔重复施加，由5毫秒的TR乘以时间序列中的40帧决定。每次行扫描的TE被设置为2ms。我们对左侧须垫进行电刺激(强度0.5 mA;持续时间，0.5 ms;将麻醉小鼠置于9.4 t扫描仪内，并对包含初级体感皮层(S1BF)右桶场的单个1毫米冠状脑切片进行成像(图1B)。在电须垫刺激下，对侧S1BF的DIANA信号与刺激前信号相比有统计学意义的增加(0.169±0.011%，p<0.001, 5只小鼠)(图1,C至E，图S1)，而在未受刺激的对照组小鼠或死后小鼠(图1,C至E，图S1)或使用琼脂假体进行的假实验(图S2)中，没有显著变化。在电激须垫开始后，DIANA信号峰值出现的潜伏期为25.00±1.58 ms(图1,C, D和F)，这表明二维快速线性扫描可以通过在毫秒范围内实现高时间分辨率来检测须垫刺激诱发的反应。为了找到体内DIANA反应的神经相关性，重复图1B中相同的电须垫刺激模式，但现在在S1BF中植入32通道硅探针的小鼠(图1G)中记录局部场电位(LFP)和单单元峰值活动(图1H)，从中分析其潜伏期(图1,I到K)。须垫刺激诱发的LFP峰值的潜伏期为39.48±1.84 ms(12只小鼠)。这明显慢于DIANA反应的潜伏期(p<0.001;图1,I和K)。然而，在刺激后时间直方图(PSTH)中，须垫刺激反应单个单元的峰值峰值发射率的潜伏期为26.44±1.24 ms(10只小鼠的27个单元)(图1J)，这与DIANA反应潜伏期(图1K)相似。其他时间峰值特征，如时间到第一峰值潜伏期，以及须突刺激响应峰值时间的中位数和模式，也与DIANA响应潜伏期相似(图S3)。随着电须垫刺激强度的增加，DIANA响应振幅和尖刺发射速率都有所增加，但峰值的潜伏期变化不大(图S4)。

图1 具有高时空分辨率的神经元活动直接成像

1.2 神经元活动传播的时空成像

由于体感刺激诱发的尖峰通过丘脑传播到S1BF，我们接下来探索了2D快速线性扫描的高时空分辨率(5 ms, 0.22 mm)是否也可以捕捉尖峰的传播。当1毫米的冠状脑切片同时包含丘脑和S1BF时，应用电须垫刺激成像(图2A)，传统的BOLD-fMRI显示丘脑和对侧和同侧S1BF同时激活(图2B和图S5)。然而，DIANA显示出具有统计学意义的反应，按丘脑、对侧S1BF和同侧S1BF的顺序依次激活(图2、C和D以及图S6、A和B)，潜伏期分别为11.50 ±0.76、24.00±1.00和28.50±3.08 ms(图2E和图S6C;10老鼠)。时间序列的进一步相互相关分析证实，丘脑反应先于对侧和同侧S1BF反应10至15 ms(图S7)。为了确定DIANA响应的时空传播戴是否匹配丘脑皮层的通路,我们在丘脑和S1BF使用两个硅探针同时执行单一单元记录(图2 F-I)。延迟峰的峰值的发射率须垫刺激响应单一单位发生顺序为丘脑(9.52± 0.90毫秒,23单位从10老鼠),对侧S1BF(24.52±1.43毫秒,23单位从五个老鼠)(图2,我和J),同侧S1BF (30.00±1.73 ms，来自一只小鼠的三个单位)(图S8)。在丘脑和S1BF中这种连续的尖峰传播在统计学上与DIANA反应中观察到的相似(图2E和图S9)。

LFPs还在丘脑(31.78±3.67 ms)、对侧S1BF (42.69 3.04 ms)和同侧S1BF (57.67 5.33 ms)中显示了顺序传播，但它们明显慢于DIANA反应(图S9)。

图2 高时空分辨率DIANA捕捉丘脑皮层的峰电位传播

1.3 光遗传DIANA实验

尽管DIANA反应的时间特征和电生理记录的体内峰值在统计上是相似的，但这些测量在某种程度上是有限的，因为它们不是同时测量的。为了更直接地验证使用2D快速线性扫描的DIANA能够成像体内的峰电位活动，我们使用了光遗传fMRI方案。在S1BF中，通过长期植入的光纤导管传递473纳米蓝光，对表达兴奋性神经元的通道视紫红质2 (ChR2)进行光遗传激活时，测量了DIANA反应(图3A)。免疫染色显示，在S1BF所有皮层层的兴奋性神经元中都有ChR2-mCherry的表达(图3B)。在蓝光刺激期间(强度为50 mW/mm2;持续时间为20 ms)， DIANA反应是每5 ms从包含丘脑和S1BF的1毫米冠状脑切片上获得50张图像的时间序列(图3C)。我们发现S1BF中有统计学意义上的DIANA信号变化，峰值响应潜伏期为15.00±1.29 ms，在光刺激开始后，丘脑中也有显著的DIANA信号变化，峰值响应潜伏期为25.00±2.98 ms(图3,D和E;10老鼠)。仅在对照组小鼠中进行蓝光刺激或仅在不进行蓝光刺激的情况下表达ChR2均不会改变DIANA信号(图S10)。当我们记录蓝光刺激诱发的 S1BF单单位活动并且相同老鼠丘脑用于光遗传DIANA实验(图3),S1BF神经元的峰电位放电频率发生在光刺激发生后9.06 ±1.59ms，从八个老鼠的34个单元,其次是丘脑峰值发射率峰值发生在21.86± 2.76ms，从四只老鼠的7个单元(图3 G I),显示反馈皮层-丘脑峰电位传播的途径。随着蓝光刺激时间的增加，DIANA反应和峰值放电速率都增加(图S11)，这表明DIANA反应与单个单元活性之间存在相似性。LFP还捕捉到了蓝光刺激诱导的皮质丘脑通路反馈激活(图S12)，在蓝光刺激开始后，LFP的峰值潜伏期分别在S1BF中为22.34±0.87 ms，在丘脑中为77.47±4.60 ms(图S12B)。

然而，LFP峰值潜伏期明显慢于光遗传DIANA的响应(图S12B)。

图3 光遗传DIANA实验:DIANA反应直接检测光遗传刺激诱发的峰值

1.4 DIANA反应为非BOLD效应

从二维快速线扫描获得的DIANA反应可能涉及血流动力学反应，如BOLD效应。为了将BOLD效应与DIANA反应分离开来，在两种条件下进行了BOLD- fmri实验：一种是默认条件，额外的氧气与空气比为1:4(氧气：空气条件)，另一种是只有空气(图4A)。纯空气条件下电须垫刺激后丘脑和S1BF的BOLD反应明显低于氧气：空气条件下(丘脑:0.626±0.052%至0.284±0.079%;对侧S1BF: 1.142±0.147%至0.792±0.166%；图4,B, C)，与BOLD激活对供氧的依赖相一致。相比之下，在氧气：空气和只有空气的条件下，DIANA反应几乎没有变化(丘脑：0.199±0.018至0.193±0.008%；对侧S1BF: 0.164±0.013% ~ 0.165±0.009%；图4,D和E)。

在数据采集方案上，理论分析发现，与传统BOLD- fmri相比，由于TE较短，TE/T2比例抑制了BOLD效应，其中TE/T2 (T2*，有效自旋-自旋弛豫时间)。例如，假设小鼠大脑T2* = 20 ms, TE设置为2 ms, 2D快速线性扫描实验的BOLD效果与BOLD- fmri相比降低到1/10(图S13)。BOLD效应进一步被抑制，因为快速、事件同步的线扫描采集与相对较短的刺激间间隔相比，缓慢变化的血流动力学反应几秒钟。在这种情况下，BOLD信号被跨所有帧(n-1)/MN≈1/M的因子抑制 (N，刺激间间隔的帧数;M，相位编码步数)。例如，在我们的DIANA实验中，对于N = 40和M = 54, BOLD效应进一步降低了0.018倍(图S13)。数值模拟验证了这些理论分析结果(图S14)。此外，在信号源方面，据报道，在7 T频率为0.75 Hz的高频刺激中，BOLD信号小至~0.021%，这预示着在5 Hz刺激中，它可能会小得多，可以忽略不计，如本研究。

DIANA反应可能的信号源是什么?基于流行的神经元电流模型的电磁效应不能作为候选，因为在神经元电流诱导的磁场变化下，质子自旋相位抵消引起的信号损失为负值，而DIANA响应在主叶中有正信号变化。

相反，由于神经元膜电位的变化可以诱导膜界面水的重新定向，DIANA反应可能源于神经元活动时MR弛豫时间的变化，如T2弛豫时间，这与膜表面水化层的水分子数量密切相关。T2弛豫时间的变化也可能归因于细胞水平的快速微观结构变化以及细胞肿胀等神经活动，这已被假定为扩散MRI的主要信号源之一。

我们使用T细胞进行模型实验，测量T细胞膜电位由不同细胞外K+浓度([K+])(图4F为4.2 - 141.0 mM，图S15A为1.0 - 4.2 mM)引起的T2弛豫时间。我们使用T细胞作为模型，因为与神经元不同，T细胞是均匀的，在体外扫描仪中可以在没有氧气供应的情况下存活。T2弛豫时间图(图4G)及数值与[K+]呈强正相关[T2斜率为0.151 ms/mM，决定系数(R2) = 0.977;图4 h]。因此，神经元活动期间膜电位的变化可能解释了T2的变化。

根据这些T2变化的测量,Bloch进行模拟,估计DIANA信号变化并且显示一个主瓣的0.139%的积极的信号变化(图S15、B和C),这实验结果相吻合(Figs 1到3)。DIANA的T2依赖反应进一步由相同的调制不同的TE的T2加权DIANA电须垫刺激实验所证实(Fig S16, A和B)。相比之下,在用不同翻转角度调制T1权重的实验中，没有观察到DIANA信号中T1相关的变化(图S16, C和D)。这是预期的，因为T1变化需要数百毫秒到几秒才能显现出来。

图4 基于二维快速线扫描的bold抑制DIANA及其假设的对比机制

1.5 丘脑皮层微回路中神经元活动传播的高时空DIANA

阐明感觉诱发的神经活动如何通过大脑多个区域的微回路传播以实现感觉知觉是感觉神经科学中长期存在的难题之一。由于我们的2D快速线扫描方法可以直接成像神经活动，不仅具有高时间分辨率(5 ms)，而且具有良好的空间分辨率(0.22 mm)，可以捕捉皮层和丘脑的微观结构，因此我们能够解决这个问题。我们从丘脑、S1BF和次级躯体感觉皮层(S2)中选择感兴趣区域(roi)(图5A)。在ROIs中，丘脑被细分为后内侧组(POm)、腹侧后内侧核腹侧部分(VPMv)和VPM背侧部分(VPMd)，而S1BF和S2在解剖学上被分为L2/3、L4、L5和L6皮层层(图5A)。从这11个roi中，重新分析了电须垫刺激过程中获得的DIANA数据。

为了进行比较，我们还在相应的丘脑皮层微回路中进行了活体单单元峰值记录(图5B和图S17)。

电须垫刺激下DIANA信号的热图和百分比变化显示，在丘脑的细分以及S1BF和S2的皮层层，不同的时间空间神经活动传播特征与体内记录的单单位峰值相似(图5、C到H和图S18)。在丘脑中，DIANA峰值信号和峰值脉冲发放速率都是从VPMv开始的，其次是POm和VPMd(图5,C和D)。在S1BF中，DIANA峰值信号和峰值脉冲发射速率都是在L4和L5开始的，之后传播到L6和L2/3(图5,E和F)，这与体内观察一致。在S2中，无论是峰值DIANA信号还是峰值发射速率，L4和L6都是最先被激活的层，之后L5和L2/3被激活(图5,G和H)，这表明S2和S1BF之间的神经活动传播轮廓有明显的不同。

为了进一步研究DIANA反应的时间动态与神经活动之间的相关性，我们分析了30%的DIANA反应峰值和峰值放电率发生的时间点(图S19)，但没有显著差异(图S19)。此外，多单元活动(MUA)峰值放电率的潜伏期与DIANA反应的潜伏期相似(图S20)。

尽管在所有roi中，DIANA响应与峰值和MUA具有较高的时间相关性(图5和图S20)，但正如图4中的T细胞实验所表明的那样，它们可能不是检测峰值本身，而是检测去极化膜电位的变化。

同时记录细胞内的神经元在DIANA技术上是困难的。

然而，电流源密度(CSD)分析允许在皮层中以特定层的方式估计跨膜电流流入神经元(电流汇)。事实上，我们的数据中的CSD分析显示，第一个电流汇聚的延迟与S1BF和S2每层中DIANA响应的延迟相似(图S21)，这表明每层中正离子流入神经元引起的膜去极化可能已经表现为正向的DIANA响应。

DIANA热图还显示了两个具有统计学意义的负DIANA百分比信号变化，分别发生在S1BF和S2的选定层的阳性DIANA响应峰值之前(图5,C到H和图S22)和丘脑、S1BF和S2的阳性DIANA响应峰值之后(图S22)。因为使用二维快速线扫描的DIANA可以潜在地成像神经网络的超极化(图S15A)，兴奋性神经元中含有γ氨基丁酸(GABA能)的抑制性中间神经元介导的超极化可能已经在DIANA反应中表现出来。基于DIANA信号，感觉输入依次通过VPMv、POm和VPMd进行传播，之后它们被抑制，以确保感觉输入的初始阶段能够可靠地在S1BF和S2的皮层层内传播，而不被其他丘脑输入中断(图5、C、E和G)。此外，丘脑输入首先抑制S1BF的L2/3和L4，而在S2中，L5先被抑制。这可能有助于在S1BF和S2中观察到的独特的层流特异性信号传播分布(图5,C, E和G)。因此，这里观察到的DIANA信号可能提供了关于神经回路的时空动态激励和抑制如何引导感觉诱发信号流的第一个实验线索。

图5 亚层特异性的DIANA响应揭示了功能上不同的亚层特异性微电路。

2.讨论

总之，我们的结果表明，2D快速线扫描方法能够以高时间(5 ms)和空间(0.22 mm)分辨率直接映射体内的峰电位活动，这一点通过体内电生理学与光遗传学相结合得到证实。如此高的2D快速线扫描DIANA的时间分辨率允许通过丘脑皮层和皮质丘脑通路中功能定义的神经网络检测神经元活动的顺序传播。二维快速线扫描DIANA还能够揭示丘脑下核和皮层层水平上多个功能连接的大脑区域(如丘脑、S1BF和S2)的时间神经网络动态。

在二维快速线扫描DIANA中，毫秒时间分辨率是直接测量神经元活动的关键因素，因为它有助于有效地捕捉神经元活动在毫秒内的瞬态效应。DIANA响应随着时间分辨率的降低而降低(图S23)。

这解释了为什么在以前的高时间分辨率fMRI研究中没有发现DIANA反应，包括基于线扫描的最高时间分辨率为40 - 50 ms的fMRI研究(图S24)。即使在单次单片回波平面成像中也没有DIANA响应，可获得的最短采集时间为20 ~ 30 ms(图S25)。

2D快速线扫描DIANA的另一个重要特征是能够有效抑制BOLD效应，其独特的数据采集方案使用了快速、事件同步的线扫描，TEs短至几毫秒，刺激间间隔相对较短(图S13和S14)。

与LFP相比，DIANA信号与峰值具有更高的时间相关性(图1,I和J, 2I和3I)，这表明DIANA可能是检测由引起峰值而不是LFP的电流流诱导的信号。通常，LFP电压是由细胞外空间中多个神经元的流入电流和流出电流之和产生的，因此电压在μV范围内。相比之下，单个神经元的膜电位及其峰值的变化在mV范围内，是LFP的10^3倍。DIANA信号可以在mV尺度上捕捉膜电压的变化，如图4中的T细胞实验所示，其中细胞外[K+] 5至145 mM的变化对应于膜电位从40至10 mV的变化。此外，二维快速线扫描可以检测到去极化和超极化膜电位的变化为DIANA的正、负信号变化(图4、图5和图S15)。CSD分析显示，第一个电流汇的潜伏期与峰值正DIANA响应的潜伏期高度相关(图S21)。

将DIANA的负信号变化与CSD分析结果联系起来是不可能的。

然而，据报道，在S1BF的体感觉信息处理过程中，快速尖峰的GABA能中间神经元和超极化兴奋性神经元的生长抑素阳性中间神经元在两个不同的时间点尖峰，类似于从阴性DIANA反应中观察到的两个不同的时间点(图S22)。GABA能中间神经元活性与负性DIANA反应之间的关系有待进一步研究。尽管如此，这些结果共同支持了我们的假设，即DIANA信号可能归因于神经元膜电位在mV尺度上的变化，其表现为跨膜电流流量的变化。

总之，我们希望高分辨率的DIANA能够为神经成像开辟新的途径，从而更准确、更深入地了解大脑的功能组织。特别是，通过DIANA实现的高时间和空间分辨率的收敛有助于阐明神经网络的时间和空间动态及其功能之间的因果关系。

参考文献：In vivo direct imaging of neuronal activity at high temporospatial resolution