Science Advances:胶质细胞功能障碍导致抑郁症静息态fMRI功能连接异常

1. 摘要

重度抑郁症（MDD）是一种毁灭性的精神障碍，影响着全球高达17%的人口。尽管通过静息状态功能磁共振成像（rsfMRI）检测的MDD患者存在全脑网络水平的异常，但这些网络变化的机制尚不清楚，尽管它们在抑郁症的诊断和管理方面具有巨大的潜力。在这里，我们发现星形细胞钙缺乏小鼠，肌醇1,4,5-三磷酸型2受体敲除小鼠（Itpr2−/−小鼠），在抑郁相关网络中显示异常的rsfMRI功能连接（rsFC），特别是内侧前额叶皮层（mPFC）相关通路的rsFC减少。我们进一步发现MDD患者的rsFC下降与Itpr2−/−小鼠高度一致，特别是在mpFC相关通路中。在Itpr2−/−和野生型小鼠中，mPFC星形胶质细胞的光遗传激活部分增强了抑郁症相关网络中的rsFC。mPFC神经元或mPFC-纹状体通路的光遗传激活挽救了Itpr2−/−小鼠中被破坏的rsFC和抑郁样行为。我们的研究结果确定了先前未知的星形胶质细胞功能障碍在驱动抑郁症患者rsFC异常中的作用。

2. 引言

高终生患病率（~17%）和导致残疾和自杀的主要原因使重度抑郁症（MDD）成为一种毁灭性的精神疾病。识别抑郁症的病理生理机制的努力涉及到特定的大脑回路和网络中的神经元通信。静息态功能磁共振成像（rsfMRI）是一种强大的非侵入性工具，通过量化静息态功能连接（rsFC），自发血氧水平依赖（~0.1Hz）（BOLD）MRI信号波动，在全脑尺度上的相关性。越来越多的证据表明，抑郁症患者在参与情绪处理的关键功能中枢中表现出异常的rsFC，如腹内侧前额叶皮层（vmPFC）、背外侧PFC（dlPFC）、前扣带回（ACC）、杏仁核（AMY）、丘脑（TH）、纹状体（Str）和海马体（HP）。此外，基于功能失调的rsFC的不同模式，抑郁症的重新分类提高了对治疗反应的预测。此外，rsFC引导的神经调节治疗与治疗难治性抑郁症的缓解相关。尽管rsfMRI在诊断抑郁症和指导抑郁症治疗方面具有巨大的潜力，但抑郁症中rsfMRI连接异常的机制仍不清楚。

星形胶质细胞是哺乳动物大脑中最丰富的神经胶质细胞类型，它与抑郁症密切相关。来自对抑郁症患者的尸检分析和动物研究的证据发现，情绪相关脑区域的星形细胞密度、标记物和胶质递质的变化，包括vmPFC、dlPFC、ACC、AMY、TH、Str和HP。此外，星形胶质细胞调节突触传递和可塑性，介导髓鞘轴突兴奋性和传导速度，同步其邻近神经元的活动，并调节大脑区域的神经元通信。此外，星形细胞内固有的Ca2+与全脑自发性BOLD波动相关。这些研究表明，星形胶质细胞可以作为支持rsfMRI连接的关键候选机制。然而，星形胶质细胞在rsfMRI连接中的作用对于正常和抑郁的大脑仍未得到充分的研究。

星形胶质细胞的激活表现为细胞内Ca2+信号的升高，主要由肌醇1、4,5-三磷酸（IP3）途径介导，而IP3受体2型（IP3R2）是星形胶质细胞中主要的功能性IP3R亚型。IP3R2敲除（Itpr2−/−）小鼠在星形胶质细胞中表现出强烈的Ca2+信号减弱，但在神经元中没有。我们之前证实了Itpr2−/−小鼠在强迫游泳试验（FST）和蔗糖偏好试验（SPT）中表现出抑郁样行为。星形胶质细胞的Ca2+信号可以通过星形胶质细胞特异性的光遗传刺激而有效地增加。因此，我们在Itpr2−/−小鼠中整合了全脑rsfMRI和细胞类型特异性的光遗传学工具，并结合在人类抑郁症患者中进行了rsfMRI分析。我们假设星形胶质细胞功能障碍是抑郁症患者rsfMRI连接异常的一个之一。为了阐明星形胶质细胞功能障碍是否导致抑郁症中异常的rsfMRI连接，我们研究了Itpr2−/−小鼠中星形胶质细胞特异性功能损失和获得对全脑rsFC的影响，以及异常的rsFC和抑郁样行为之间的关系。

3. 结果

3.1 星形胶质细胞功能障碍会破坏全脑rsFC

星形胶质细胞钙缺乏小鼠，即Itpr2−/−小鼠，在尾悬吊试验（TST）和FST中表现出预期的抑郁样行为,正如我们之前所演示的。为了研究星形胶质细胞功能障碍是否有助于抑郁症患者的rsfMRI连接异常，我们首先通过比较Itpr2−/−和野生型（WT）小鼠的全脑功能连接障碍，研究了星形胶质细胞Ca2+活性的降低如何影响rsFC。我们对所有的rsfMRI数据进行了独立成分分析（ICA），并确定了53个稳健的rsFC成分。在这些ICA检测到的rsFC成分和图谱的基础上，将94个空间分离的左右对称脑单位（即47个脑区）定义为感兴趣区域（ROI），计算成对相关矩阵。

全脑两两相关矩阵的组间比较显示，与WT小鼠相比，Itpr2−/−小鼠的全脑rsFC有显著变化（图1A和B）。我们根据与每个ROI相关的整体连通性变化对ROI进行排序，根据rsFC变化的平均效应大小（Cohen’sD）量化为“节点调制指数”（NMI）。18个ROI在NMI >0.7时表现出较强的效应。这18个ROIs分别对应于内侧PFC（mPFC）、TH、Str、躯体感觉皮层（SsCx）、钩叶（Hb）、AMY、中缝背核（DRN）、视觉皮层（VCx）、上丘（SC）和小脑前叶（Ant；图1C)，这在之前曾被证明与抑郁症相关（以下称为抑郁症相关网络）。HP和腹侧被盖区（VTA）是另外两个抑郁的抑郁中枢，它们的rsFC与其他脑区没有明显的变化(图1A和B)。

为了量化Itpr2−/−小鼠中最受影响的脑区中rsFC的变化，我们计算了抑郁相关网络中的效应大小（Itpr2−/−小鼠与WT小鼠）（图1D）。效应量分析显示，相对于WT小鼠，Itpr2−/−小鼠中mPFC-Str、mPFC-AMY、mPFC-SsCx、mPFC-VCx、TH-Str、THAMY、TH-SsCx、TH-VCx、Str-SC、Str-SC、SnT-AMC-SC、Ant-VCx、Hb-Str、Hb-AMY、Hb-SsCx、Hb-VCx、DRNStr、DRN-AMY和DRN-VCx通路的rsFC显著降低（图1D和E）。而IP3R2敲除增加了DRN-Ant、mPFC-DRN、DRN-TH、Hb-SC和SsCxVCx通路中的rsFC（图1D和E）。由于TST和rsfMRI实验都是在同一只动物上进行的，因此我们进一步研究了rsFC与TST中的行为表现之间的相关性。值得注意的是，六个路径表现出负相关和静止时间，包括mPFC-Str[r = −0.5790, false discovery rate (FDR)–corrected P = 0.0171]，mPFC-AMY (r = −0.5892, FDR-corrected P = 0.0171), mPFC-SsCx (r =−0.5912, FDR-corrected P = 0.0171), TH-Str (r = −0.5698, FDR-correctedP  =  0.0171), TH-AMY (r = −0.5765, FDR-corrected P = 0.0171),和TH-SsCx (r = −0.5861, FDR-corrected P = 0.0171)路径。这些结果表明，星形胶质细胞功能障碍可导致全脑范围内的rsfMRI连接异常，从而预测抑郁样行为，特别是在与抑郁症相关的网络中。

图1.通过rsfMRI绘制Itpr2−/−和WT小鼠的全脑功能连接图谱。（A和B）Itpr2−/−和WT小鼠（Itpr2−/−和WT小鼠分别为11和13只小鼠）的rsFC组间统计比较，如矩阵(A)和网络图(B)显示这些节点对应于ICA检测到的47个脑区。独立样本t检验，P < 0.05，多重比较的错误发现率（FDR）校正；只显示了显著改变的路径（FDR校正的P < 0.05）。(C)47个脑区按整体rsFC变化的顺序排列，前18个ROI（平均效应大小> 0.7）见(C) to (E)。效应大小矩阵(D)和示意图(E)显示了前18个ROI之间的rsFC的变化。MCx，运动皮层；ACx，听觉皮层；ICx，岛叶皮层；Cg/Rs，扣带/脾后皮层；OCx，眶皮层；Acb，伏隔核；LS，侧隔核；Hb，下丘；IL，边缘下皮层；PrL，前边缘皮层；CM，丘脑中央内侧核。

3.2 MDD患者和Itpr2−/−小鼠的rsFC变化具有特征性的一致

Itpr2−/−小鼠的rsFC的变化主要发生在与抑郁相关的网络中，包括mPFC、Str、AMY、TH、SsCx、VCx、Ant、SC、DRN和Hb（图1C-E）。在这些结果的指导下，我们接下来通过分析REST-meta-MDD联盟的rsfMRI数据集，评估MDD患者中抑郁症相关网络是否也存在类似的变化。人类rsfMRI数据集为我们提供了从人类图谱定义的ROI中提取的时间序列，其中包括除SC、DRN和Hb外的上述抑郁症相关网络中的大部分脑区。经过预处理和数据排除以确保数据质量（详见材料和方法），从中国21个研究地点招募了1080例MDD患者（MDD）和931例正常对照（NC）进行后续统计分析（图2a）。vmPFC的rsFC被分析为人类vmPFC与啮齿动物mPFC同源。我们发现，与NC组相比，MDD组的vmPFC-Str、vmPFC-AMY、TH-Str、TH-AMY、vmPFC-SsCx、TH-SsCx、TH-VCx、Ant-Str、Ant-Ant-SsCx、Ant-VCx通路的rsFC显著降低，与Itpr2−/−小鼠的rsFC改变一致(图2C和D)。mPFC-VCx通路的rsFC在Itpr2−/−小鼠中显著下降，但在抑郁症患者中没有改变(图2C和D)。在Itpr2−/−小鼠中，Str-SsCx通路和AMY-SsCx通路的rsFC显著增加，而在MDD患者中则显著降低。在MDD患者中，Str-AMY、vmPFC-TH、vmPFC-Ant和TH-Ant通路的rsFC显著降低，但在Itpr2−/−小鼠中没有改变。

虽然头部运动在个体水平上回归，然后作为线性混合模型（LMM）分析的协变量，但我们在排除有大运动的受试者后额外进行了分析，以验证我们的研究结果。我们发现，除TH-VCx外，MDD患者无论使用中度（排除平均帧级位移（FD）>0.2mm的受试者）或严格（排除平均FD>0.1mm的受试者）头部运动控制，大多数rsFC下降仍然显著。此外，我们使用Craddock的功能聚类图谱，使用不同的分割方案重新运行了分析。我们再次发现，大多数通路，包括vmPFC-Str、vmPFC-AMY、vmPFC-SsCx、Ant-AMY、Ant-Str、Ant-SsCx和Ant-VCx，在MDD组中的rsFC仍然显著降低，尽管TH-Str、TH-AMY、TH-SsCx、TH-VCx和vmPFC-VCx的rsFC变化不显著。综上所述，这些结果表明，抑郁症患者和Itpr2−/−小鼠中rsFC的改变是高度一致的，并且与其他大脑区域相比，与mPFC相关的rsFC的变化是最稳健和一致的。

图2.MDD患者的rsFC减弱，与Itpr2−/−小鼠一致。(A)MDD患者（1080个 MDD）和正常对照组（931个 NC）的样本量。横轴代表来自中国的21个研究地点。(B)ROI的位置和数据分析示意图。对于每个被试，通过计算BOLD信号的皮尔逊相关系数(r)生成rsFC，然后转换为Fisher的z分数，与这个代表性被试一样。(C)小提琴图显示了MDD和NC主题的rsFC的分布。线性混合模型。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，和****P < 0.0001；FDR为多重比较校正，n.s.，无显著性。(D)MDD患者和Itpr2−/−小鼠的rsFC变化相似。

3.3 mPFC星形胶质细胞的光遗传激活增强了抑郁症相关网络中的rsFC

细胞类型特异性光遗传刺激是选择性增加星形细胞Ca2+信号的有效方法。为了进一步确定星形胶质细胞在抑郁症中rsFC中的作用，我们直接研究了mPFC星形胶质细胞的光遗传刺激对抑郁症相关网络的影响。我们通过将神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子（gfaABC1D）下表达ChR2的腺相关病毒（AAV）注射到WT或Itpr2−/−小鼠的mPFC中，选择性地刺激星形胶质细胞（图3A和B）。共聚焦图像显示，大多数mcherry阳性细胞共表达GFAP（94.51%），一种星形细胞标记物（图3C和D）。

然后，我们在10hz蓝光（473 nm）对mPFC星形胶质细胞进行光遗传激活之前和光遗传激活期间进行了rsfMRI实验fMRI激活图显示mPFC中BOLD活性增加（图3F）。效应大小分析显示，光遗传刺激星形胶质细胞增加了Itpr2−/−和WT小鼠的mPFC-Str、mPFC-AMY、DRN-VCx、Str-SsCx、Str-VCx、AMY-SsCx和AMYVCx通路的rsFC，尽管效应中等（效应大小> 0.5；图3G和H）。比较Itpr2−/−小鼠中Itpr2敲除和mPFC星形胶质细胞光遗传激活导致的rsFC变化趋势，我们发现51%（153人中有78条）的通路显示rsFC呈相反方向的变化。在这78条通路中，Itpr2−/−和WT小鼠之间的rsFC差异与Itpr2−/−小鼠在光遗传激活mPFC星形胶质细胞之前和光遗传激活期间的rsFC差异呈负相关。其中，78条通路中有67条显示rsFC随着Itpr2的敲除而减少，但随着星形胶质细胞的激活而增加，而其余的通路显示rsFC随着Itpr2的敲除而增加，但随着星形胶质细胞的激活而减少。这些结果表明，mPFC星形胶质细胞的光遗传激活可以缓解Itpr2敲除诱导的rsFC改变。

接下来，我们对在同侧mPFC中定义的种子进行了基于种子的分析（SBA）。相关系数（CC）图和定量分析也显示，在Itpr2−/−和WT小鼠中，在mPFC星形胶质细胞的光遗传激活过程中，同侧mPFC-Str rsFC显著增加（图3I-L）。这些结果表明，通过光遗传刺激增加mPFC星形胶质细胞中Ca2+信号可以减轻抑郁相关网络中rsFC的改变，特别是部分增强星形胶质细胞功能障碍导致的rsFC降低。

图3. mPFC星形胶质细胞的光遗传刺激增加了抑郁症相关网络中的rsFC。(A)显示病毒注射和光纤植入的示意图。(B)共聚焦图像显示mPFC星形胶质细胞中ChR2的表达。红色，ChR2-mCherry；绿色，GFAP；蓝色，4‘，6-二氨基-2-苯乙烯醇（DAPI）。比例尺，500m（左）和25m（右）。(C)ChR2-mCherry与GFAP（左）或NeuN（右）共定位的代表性组织学。(D)定量分析与GFAP共定位的chr2阳性细胞（n=290m樱桃阳性细胞；12个视野；4只小鼠）和NeuN（n=409m樱桃阳性细胞；17个视野；4只小鼠）的百分比。(E)fMRI扫描时间线示意图及相应的范式。(F)在10hz的刺激下，具有代表性的激活图。(G)效应大小矩阵（Cohen’sD>0.5）显示光遗传刺激对WT（n=14；左下）和Itpr−/−小鼠（n=8；右上）抑郁相关网络中同侧rsFC的影响。蓝色的矩阵框表示mPFC-Str rsFC的效应大小。(H)效应大小示意图显示，WT和Itpr2−/−小鼠的同侧rsFC共同增加。（I和J）WT和Itpr2−/−小鼠在光遗传刺激前和光遗传刺激期间的同侧mPFC的静息状态相关图。(K) Str ROI用于提取mPFC（I和J）的rsFC图中的CC值。(L)在WT和Itpr2−/−小鼠中进行同侧mPFC-Str的rsFC的定量分析。双向方差分析（ANOVA），然后采用Sidak多重比较检验，数据表示为均值± SEM，**P < 0.01。

3.4 Itpr2的缺失减弱了mPFC到str神经元的通信

功能连接与神经通信有关，而神经通信可以由星形胶质细胞来调节。为了了解星形胶质细胞是如何调节rsFC的，以及它是否通过调节神经元通信，我们使用锰增强MRI（MEMRI）来确定星形胶质细胞功能障碍是否影响神经元通信，如果是，哪些mPFC相关通路的影响最大。MEMRI是一种评价神经元的有效方法贯穿整个大脑的交流。Mn2+是一种钙离子类似物，可通过电压门控钙通道被可兴奋的神经元吸收，然后以活动依赖的方式沿着轴突运输。

我们首先将氯化锰注入Itpr2−/−和WT小鼠的mPFC中，并在注射后的前24.5小时内追踪Mn2+的积累（图4A和B）。我们观察到Mn2+诱导的Str(腹侧Str（vStr）、背侧Str（dStr）和外侧苍白球（LGP）]、TH、AMY和VTA（图4C）的信号增强。然后，我们对从覆盖这些大脑区域的已定义的ROI中提取的信号强度进行了定量分析（图4D）。与野生型小鼠相比，我们发现Mn2+的积累减少Mn2+给药4.5小时后，从mPFC到vStr、dStr和LGP的纤维束，在Itpr2−/−小鼠中，8.5小时后vStr和LGP持续减少。相比之下，在TH、AMY和VTA时，Mn2+的积累没有明显的差异（图4E和F）。这些结果表明，星形胶质细胞功能障碍降低了神经元通讯，而mPFC-Str通路是Itpr2−/−小鼠和抑郁患者中唯一显著受影响的神经回路。

图4.Itpr2的缺失会损害mPFC-str神经元的通信。(A)示意图和具有代表性的T1加权图像显示了氯化锰的注射部位。(B)动态锰增强MRI（MEMRI）的实验范式。(C)具有代表性的WT小鼠三维最大密度投影图像显示输注8.5小时后Mn2+增强的扩散。(D)对ROI的定义。(E)平均彩色编码的MEMRI图像。(F)在定义的ROI中Mn2+动态积累的定量分析。双向重复测量方差分析，然后进行Sidak多重比较检验；*P<0.5，每组n=9只小鼠。数据用均值± SEM表示.

3.5 mPFC神经元的光遗传激活挽救了rsFC和抑郁样行为

通过光遗传刺激直接调节mPFC相关通路的神经元通信，我们试图进一步确定Itpr2−/−小鼠中星形胶质细胞功能障碍引起的异常rsFC与抑郁样行为之间的关系。我们将AAV-CamkII-hChR2-mCherry或AAV-CamkII-mCherry注射到Itpr2−/−小鼠的mPFC中，并在感染细胞上方插入一根光纤（图5A和B）。体外全细胞记录显示，10hz的光遗传刺激在脑切片中表达chr2的神经元中诱发了强大的动作电位（图5C）。我们在10hz光遗传刺激前后分别进行了功能磁共振成像扫描。在每次刺激后阶段之前，进行20秒的光遗传刺激来激活表达chr2的神经元（图5D）。mPFC的单侧光遗传刺激诱发了同侧BOLD活性的增加，主要发生在mPFC和Str，也发生在其他大脑区域，包括扣带皮层、Hb和VTA(图。S8A).在mcherry对照组小鼠中未观察到激活。mPFC中诱发的BOLD信号在刺激开始后~3 s开始上升，在刺激偏移后~40 s恢复到基线水平。

接下来，我们分析了在小鼠rsfMRI结果中发现的18个ROI中的效应大小（刺激后和预刺激后）（图1C到E）。我们发现，在光遗传刺激后，在表达chr2的小鼠中，mPFC-Str、mPFC-AMY、AMY-SsCx、DRN-TH和SsCx-SC通路中的rsFC增加（图5E和H）。其他通路，如TH-Str、TH-AMY、Hb-Str等，均无明显变化（图5E和H）。与mCherry对照组相比，Chr2表达组mPFC-Str和mPFC-AMY通路中rsFC显著增加（图5F和G）。在chr2-SsCx、DRN-TH和SsCx-SC通路中，表达小鼠的rsFC显著增加，尽管组间rsFC改变的差异不显著。进一步对mPFC-Str和mPFC-AMY通路中的rsFC进行定量分析，发现rsFC的增加接近于WT小鼠的水平。在表达chr2的小鼠中，SBA也显示了光遗传刺激诱导的mPFC-Str 的rsFC的增加，但在mcherry对照小鼠中没有（图5I和K）。此外，通过比较Itpr2敲除和mPFC神经元光遗传激活导致的rsFC变化趋势，我们还发现51%（153人中有78条）的通路的rsFC变化呈相反的方向。在这78条通路中，在71.79%（78个通路中的56个）的通路中，mPFC神经元的光遗传激活与mPFC星形胶质细胞的光遗传激活变化方向相同。同样，Itpr2−/−与WT小鼠之间的rsFC差异与Itpr2−/−小鼠在−神经元光遗传激活前后的rsFC差异呈负相关。其中，78条通路中有60条显示rsFC随着Itpr2的敲除而减少，但随着mPFC神经元的激活而增加，而其余的通路显示rsFC随着Itpr2的敲除而增加，但随着mPFC神经元的激活而减少。

然后，我们在平行行为实验中研究了Itpr2−/−和WT小鼠在光遗传激活mPFC神经元1 min后的行为表现（图5J）。与Itpr2−/−小鼠，表达ChR2表达的Itpr2−/−小鼠在TST（P = 0.0095）和FST（P = 0.0197）和显著增加蔗糖偏好（P < 0.0001）光遗传激活mPFC神经元后，他们的抑郁行为表现获救水平类似于WT小鼠(图5L和M).光遗传刺激对WT小鼠在TST（P = 0.9597）和SPT（P = 0.4394；图5L和M）中的行为表现无显著影响。不同组一般运动能力无明显差异（图5N)。综上所述，这些结果表明，mPFC神经元的光遗传激活部分挽救了rsFC，特别是mPFC和mPFC-AMY rsFC，并挽救了Itpr2−/−小鼠的抑郁样行为。

图5.mPFC神经元的光遗传激活挽救了ItPr2−/−小鼠的部分rsFC和抑郁样行为。(A)显示病毒注射和光纤植入的示意图。(B)共聚焦图像显示mPFC内神经元中ChR2的表达。红色，ChR2-mCherry；蓝色，DAPI。比例尺，500m（左）和50m（右）。(C)体外切片记录（3只小鼠的n=4个神经元）。(D)光遗传学功能磁共振成像扫描范式。(E)效应大小矩阵显示，在chr2表达小鼠（n = 10；左下部分）和对照组小鼠（n = 9；右上-部分）的抑郁相关网络中，光遗传刺激对同侧rsFC的影响。（F和G）光遗传刺激前后同侧mPFC-Str和mPFC-AMY rsFC在光基因刺激前后的定量分析。以组（对照组与ChR2）和时间（前与后）为因素的双向方差分析，然后采用Sidak多重比较检验。(H)表达chr2的小鼠同侧rsFC的效应大小示意图。（I和K）同侧mPFC的平均静息状态相关图。(J)行为测试的示意图（顶部）和时间线（底部）。（LN）行为表现Itpr2−/−和WT小鼠TST，蔗糖偏好（SPT）和野外测试（OFT）光遗传刺激。双因素方差分析，Sidak多重比较检验。所有数据均以均值± SEM表示。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，和****P < 0.0001。

3.6 mPFC-Str投射的光遗传激活挽救了rsFC和抑郁样行为

结合MEMRI和mPFC神经元光遗传激活的结果(图4和5)，我们发现mPFC-Str通路可能是Itpr2−/−小鼠介导抑郁行为的最重要的神经回路，因为Mn2+在mPFC-AMY通路中Mn2+的积累没有变化（图4E和F）。接下来，我们使用光遗传刺激选择性地调节Itpr2−/−小鼠中的mPFC-Str投射。将AAV-CamkII-hChR2-mCherry或AAV-CamkIImCherry单侧注射到Itpr2−/−小鼠的mPFC中，并将光纤植入同侧Str上方，以便将蓝光传递到mPFC的轴突（图6A和C）。共聚焦图像证实了Str中mPFC轴突末端上ChR2的表达（图6B）。fMRI激活图显示，在光遗传刺激期间，双侧Str和同侧mPFC的BOLD活性增加，但在mcherryy对照小鼠中没有。

接下来，我们分析了18个ROI之间的效应大小，数据显示，在光遗传刺激后，mPFC-Str、mPFC-AMY、Hb-SsCx、Ant-AMY、AMY-SC、Hb-AMY、TH-AMY和DRN-AMY通路中的rsFC增加（图6D和E）。TH-Str、Hb-Str等其他通路均未见明显变化（图6D和E）。相对于mcherry-对照组，chr2表达组在mPFCStr、mPFC-AMY、Hb-SsCx和Ant-AMY通路中的rsFC显著增加(图6F至I)。在表达chr2的小鼠中，rsFC在AMY-SC、Hb-AMY、TH-AMY和DRN-AMY通路中显著增加，而在mCherry细胞对照小鼠中没有，尽管各组间rsFC改变的差异不显著。对mPFC-Str和mPFC-AMY通路中的rsFC的定量分析显示，rsFC的增加接近于WT小鼠的水平。与mPFC神经元的光遗传刺激结果相比（图5E和H），mPFC-Str投射的激活增加了更多的rsFC，这些增加的rsFC主要集中在AMY-、Ant-和Hb相关的神经回路中（图6D和E）。这些结果表明，Itpr2−/−小鼠中AMY-、Ant-和Hb相关神经回路的rsFC的变化与Str活性有关。接下来，我们用在同侧mPFC中定义的种子进行SBA。CC图还显示，与mcherry-对照组相比，选择性激活chr2表达小鼠的mPFC-Str投射后，mPFC-Str rsFC增加（图6J和K）。值得注意的是，当比较Itpr2敲除和mPFC-Str投射的rsFC变化趋势时，我们发现56%（153条中的86条）的通路显示了rsFC相反方向的变化。S11A).在这86条通路中，在79.09%（86个通路中的68个）的通路中，mPFCStr投射的光遗传激活导致了与mPFC星形胶质细胞的光遗传激活变化方向相同。.同样，Itpr2−/−和WT小鼠之间的rsFC差异与Itpr2−/−小鼠在光遗传激活mPFC-Str投射前后的rsFC差异呈负相关。其中，86条通路中有72条显示rsFC随着Itpr2的敲除而减少，但随着mPFC-Str投影的激活而增加，而其余的通路显示rsFC随着Itpr2的敲除而增加，但随着mPFC-Str投射的激活而减少。

然后，我们在平行行为实验中研究了Itpr2−/−和WT小鼠在选择性光遗传激活−通路1 min后的行为表现（图6J）。我们发现，相对于mcherry控制组，Itpr2−/−小鼠Chr2Itpr2−/−小鼠表现出显著减少静止时间在TST（P = 0.0012）和蔗糖偏好显著增加（P = 0.039；图6K和L）。两组WT小鼠在TST（P = 0.9996）和SPT (P = 0.9914)中的行为表现无显著差异（图6K和L)。值得注意的是，不同组的一般运动无显著差异（图6M）。综上所述，这些结果表明，mPFC-Str投射的光遗传激活挽救了大部分异常的rsFC，特别是mPFC-Str和mPFC-AMY rsFC，并在Itpr2−/−小鼠中产生了抗抑郁作用。

图6.Str中mPFC终末的光遗传激活部分挽救了rsFC和抑郁样行为。(A)显示病毒注射和光纤植入的示意图。(B)共聚焦图像显示在mPFC投射中ChR2的表达。红色，ChR2-mCherry；蓝色，DAPI。比例尺，500m（左）和50m（右）。(C)光遗传学功能磁共振成像扫描范式示意图。(D)效应大小矩阵显示光遗传刺激对chr2表达小鼠（n=12；左下）和对照小鼠（n=10；右上）抑郁相关网络中同侧rsFC的影响。(E)chr2表达小鼠同侧rsFC的效应大小示意图。（F-I）光遗传刺激前后同侧mPFC-Str、mPFC-AMY、Hb-SsCx和Ant-AMYrsAMFC的定量分析。采用Sidak的多重比较检验的双向方差分析。(J)行为测试的实验时间表。（KM）Itpr2−/−和WT小鼠在TST、SPT和OFT。双因素方差分析，Sidak多重比较检验。所有数据均以均值± SEM表示。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，和****P < 0.0001。（N和O）mPFC-str投射光遗传激活后同侧mPFC前后的平均静息状态相关图。

4. 讨论

  在这里，我们发现Itpr2−/−小鼠在抑郁相关网络中表现出减少的rsFC特征。MDD患者与Itpr2−/−小鼠表现出高度一致的rsFC变化。我们可以通过星形细胞的激活来部分挽救这一特征。此外，使用光遗传刺激，特别是mPFC-Str rsFC来增强mPFC相关的rsFC，与Itpr2−/−小鼠的抑郁样行为的改善相平行。这些结果表明，星形胶质细胞功能障碍导致抑郁症患者的rsfMRI连接异常。我们的工作为星形细胞的机制和rsfMRI测量的抑郁症网络畸变之间可能的合理因果关系提供了一个先前未知的机制洞察力。

许多研究已经检查了抑郁症患者和动物模型中的rsfMRI网络，产生了高度定量和客观的测量结果，具有治疗方面的实用价值。然而，星形胶质细胞功能障碍与抑郁症患者的rsfMRI测量结果之间的关系尚不清楚。在这里，我们的研究结果显示，Itpr2−/−小鼠中异常的rsfMRI连接可以通过光遗传刺激的星形细胞特异性激活来部分挽救。我们的结论是，星形胶质细胞功能障碍是抑郁症患者发生rsfMRI连接异常的一个促进因素。这一结论与星形细胞特异性基因与抑郁症中的rsfMRI连接变异性表现出很强的空间关联相一致。

在本研究中，调节抑郁相关通路（如mPFC-Str通路）中的rsfMRI连接性会影响Itpr2−/−小鼠的抑郁样行为，这也得到了先前的人类神经成像研究的支持。例如，在抑郁症患者中，vmPFC和腹侧Str之间的rsFC减少，而在有效治疗抑郁症后增加。值得注意的是，尽管MDD中mPFC-Str rsFC也有报道，但这种差异可能来自于小样本量或不同的ROI选择。我们的研究发现，在大样本量的MDD患者（n = 1080例患者；n = 931对照组）和两种不同的ROI分割方案中，mPFC-Str rsFC的减少，证实了我们在星形胶质细胞功能障碍动物模型中的结果。我们发现，通过光遗传激活mPFC神经元或mPFC-Str通路来增强mPFC-Str rsFC，挽救了Itpr2−/−小鼠的抑郁样行为，但不影响WT小鼠的行为表现。另一项对正常大鼠进行的光遗传学研究显示，在使用步进功能视蛋白（SSFOs）异步增强mPFC的兴奋性后，蔗糖偏好和社会交互作用降低。这里的矛盾发现可能是由于mPFC及其下游区域被调节的神经元活动的频率不同，即在我们的研究中，SSFO激活后70-80赫兹的伽马活动增强与直接激活10赫兹的神经活动相比。然而，我们观察到的10hz的mPFC刺激的抗抑郁作用与之前在抑郁症患者和动物模型中的研究一致。总之，我们的发现揭示了mPFC-Str rsFC减少抑郁症的星形细胞机制。我们认为星形胶质细胞的功能可以作为正常化的一个目标异常的全脑功能连接网络来改善抑郁症的行为缺陷。我们的综合方法，结合人类神经成像观察、基因敲除动物模型、rsfMRI、光遗传刺激和行为测试，使我们能够揭示抑郁症和可能的其他精神疾病的人类神经成像观察的机制。

在MDD患者和Itpr2−/−小鼠中，rsfMRI连接明显改变的大脑区域可能与抑郁相关，如mPFC、TH、Str、AMY、SsCx、VCx、SC、Hb、DRN和Ant(图1和2）。这些区域与积极情绪和动机过程（mPFC和Str）、消极感觉和情感体验（AMY、SsCx、VCx、Hb和DRN）以及厌恶过程（SC和TH）至关重要，所有这些都可能影响抑郁条件下的行为。我们的研究结果和之前的研究表明，mPFC/vmPFC是抑郁症中最持续的受损区域之一。除了上面讨论的mPFC-Str rsFC减少外，在之前的研究中，rsFC减少在MDD患者中也有一致的报道，支持我们的研究结果。我们发现，与之前的研究一样，MDD患者的vmPFC和TH之间的rsFC降低，但在Itpr2−/−小鼠中没有改变。一种可能性是，这个回路的rsFC可能只在抑郁亚组的一个子集中发生改变。此外，我们发现在MDD患者和Itpr2−/−小鼠中，TH-AMY和TH-Str通路的rsFC均降低，这与之前的研究结果一致，即抑郁与TH、AMY和Str的连接降低有关。值得注意的是，我们发现MDD患者和Itpr2−/−小鼠的体感和视觉皮质中的rsFC都发生了改变，这可能与抑郁症的外感受性改变有关，如外感受性刺激的疼痛耐受性增加和视觉对比敏感性降低。我们对Itpr2−/−小鼠的研究结果和先前的研究表明，许多小的皮层下区域的功能障碍，如Hb和DRN，在抑郁症中起着重要的作用。由于有限的空间分辨率，很难检查人类rsfMRI数据来研究这些区域在抑郁症中的作用，这凸显了动物研究的重要性。

在这项研究中，我们使用光遗传刺激来选择性地操纵mPFC的活动，而不是抑郁症相关网络中的其他大脑区域，因为之前的研究和我们的结果(图1和2)表明mPFC由于星形胶质细胞功能障碍而表现出最一致和最显著的rsFC改变。一方面，先前对MDD患者的尸检分析和动物研究一致发现，PFC中存在星形细胞的异常，如形态学和数量上的变化。同时，PFC是在抑郁症中表现出高度一致的显著rsFC改变的区域之一，也是通过神经调节治疗治疗抑郁症的有效靶区。另一方面，我们对Itpr2−/−小鼠的rsfMRI结果显示，mPFC具有最大的rsFC变化，这与抑郁样行为相关(图1C)。结合Itpr2−/−小鼠和MDD患者的rsfMRI结果，我们发现mPFC相关的rsFC通路是最一致的改变通路。我们的研究结果显示，光遗传激活mPFC活性可以挽救mPFC相关通路中的rsFC，并缓解Itpr2−/−小鼠的抑郁样行为。然而，由于星形胶质细胞在调节抑郁症相关网络中潜在的类似作用，我们并不排除其他区域的网络稳态可能产生挽救作用。人类的PFC由多个细分区域组成，比啮齿类动物的mPFC要复杂得多。到目前为止，只有人类PFC的vmPFC细分被证明在啮齿类动物的mPFC中具有同源结构。在控制良好的啮齿动物mPFCrsFC研究结果的指导下，我们的研究重点分析了MDD患者vmPFC相关通路中的rsFC。然而，我们并不排除人类PFC的其他细分部分（即，在vmPFC之外）的rsFC也可能发生改变的可能性。先前的研究表明，人类PFC的其他一些细分（如dlPFC：布罗德曼细胞结构9区和46区）在MDD患者中也显示出星形细胞异常和rsFC变化。虽然这些细分在小鼠大脑中没有同源结构，但我们的研究为未来其他具有这些细分的动物模型的光遗传学rsfMRI研究提供了一个有价值的方法，如非人类灵长类动物。

对MDD患者的尸检分析证据显示，星形细胞异常主要位于PFC（vmPFC、dlPFC和ACC）、TH、AMY和Str。对啮齿类动物星形胶质细胞功能的研究支持这一观点，表明mPFC、AMY、Hb、Str和DRN中的星形胶质细胞功能障碍驱动了动物的抑郁样行为。我们的rsFC研究报告的脑区与抑郁症患者死后分析中报告的星形细胞异常之间的高度一致性表明，MDD患者的抑郁症状和rsfMRI连接减少至少部分是由星形胶质细胞功能障碍驱动的。这一证据促进了人类神经成像的观察，以确定其潜在的机制。然而，我们的发现可能与所有神经影像学研究都有一个共同的局限性，即抑郁症背后的特征良好的神经影像学特征不能与对同一患者的尸检分析配对。在未来的研究中，需要对MDD患者进行纵向调查，并将重复的神经影像学观察与相同被试的死后分析相结合。

我们还发现，在Itpr2−/−小鼠中，神经元通信的光遗传操作影响rsfMRI连接，并伴随相应的行为改变。这些观察结果表明，星形胶质细胞中IP3R2的缺失导致了功能网络及其抑郁样行为输出的破坏，可能是通过神经连接的改变。先前的研究支持这一观点，表明IP3介导的星形细胞信号减弱降低了星形胶质细胞对突触的覆盖。IP3R2基因敲除小鼠不能调节突触传递和可塑性。最终，这些基因敲除的小鼠未能在其区域内连接起断开的神经元回路。这些观察结果支持了这样一种观点，即IP3R2敲除诱导的星形胶质细胞功能障碍导致星形胶质细胞-神经元相互作用适应不良，这可能导致Itpr2−/−小鼠中rsfMRI连接的中断和抑郁相关行为。先前的研究表明，神经元Ca2+波动与次低BOLD波动相关。然而，我们知道没有证据可以像本研究中那样直接检查星形细胞活动和rsfMRI连接之间的关系。值得注意的是，我们的研究结果并不排除星形胶质细胞中IP3R2的缺失可能导致代谢活性适应不良或血管活性改变的可能性，这两种情况都可能影响rsfMRI BOLD的波动。虽然Itpr2−/−小鼠是一个全脑IP3R2敲除模型，但Itpr2−/−小鼠的rsFC改变主要位于与抑郁症相关的脑区。这可能涉及到星形胶质细胞功能、神经元亚型和星形胶质细胞-神经元相互作用的区域异质性。然而，我们的研究结果首次证明了星形细胞Ca2+有助于正常和抑郁的大脑中的rsfMRI连接。

总之，我们的研究结果揭示了抑郁症功能MRI连接畸变的星形细胞机制，统一了抑郁症病理生理学中两个不同的重要概念，即显微星形胶质细胞功能障碍和宏观功能网络突发，使用细胞类型特异性神经调节方法和全脑成像。这些结果将有助于推进rsfMRI测量的功能网络作为高度定量和可重复的抑郁症成像和治疗生物工具的更具体和机械的解释。

5. 材料和方法

5.1 小鼠

所有实验均经南方医科大学动物伦理委员会批准，并符合《实验动物事务管理条例》（中国）的规定。这些老鼠在室内饲养，在一个温度和湿度控制的房间里生长，进行12小时的光/暗循环（7点到19点亮灯），可以随意获得食物和水。所有小鼠在进行行为学测试前，每天处理5分钟，持续3天。所有的行为测试都是由在下午1点到下午5点之间不知道小组分配的观察员进行的。

IP3R2敲除小鼠是通过杂交种系杂合子零突变体Itpr2+/−小鼠获得的。小鼠品系保持在C57BL/6J背景下。利用小鼠尾DNA和等位基因特异性引物WT(5′-GCTGTGCCCAAAATCCTAGCACTG-3′; 3′-CATGCAGAG-GTCGTGTCAGTCATT-5′)和突变体(5′-AGTGATACAGGG-CAAGTTCATAC-3′; 3′-AATGGGCTGACCGCTTCCTCGT-5′)通过聚合酶链反应（PCR）对后代进行基因分型。

5.2 病毒和化学试剂

病毒AAV2/9-mCaMKII-hChR2（H134R）-mcherry-WPRE-pA（4.06×1012颗粒ml−1），AAV2/9-mCaMKII-mCherryWPRE-pA（1.60×1013颗粒ml−1）和AAV2/5-gfaABC1DhChR2（H134R）-mCherry-WPRE-pA（3.96×1012颗粒毫升−1）购自台湾生物科学（中国）。四水氯化锰（M109464）购自阿拉丁（中国）。

5.3 立体定向注入和光纤植入

小鼠（雄性，~8周）术前用1.5%异氟醚麻醉，并固定在立体定向框架中（RWD生命科学，中国）。将病毒立体定向注射到mPFC中（AP：+1.70，ML：+0.35，DV：−2.70mm；AP、ML和DV分别表示与布雷格玛的前后、中外侧和背腹距离）。使用装有33号针头的5微型注射器（美国汉密尔顿）和微型注射器，以100 nl/min的速度向每个位置注射300 nl的病毒。针头放置5 min，允许病毒扩散，然后慢慢抽出，然后用组织胶（韩国DentKist，03-396号）浇筑头皮。

对于光遗传功能磁共振成像扫描，分别在注射病毒后3周或8周植入定制的直角带状纤维（直径= 220m，数值孔径=0.5）（AP：+0.70；ML：+0.35；DV：−3.60）或+0.70；ML：=3.50)上方。带状纤维被包裹在一个黑色的不透明的热收缩套筒中，以防止在光遗传刺激过程中的光泄漏，从而引起不希望的视觉刺激。为了尽量减少对脑组织的损伤，纤维尖端被剪断，以形成一个斜面，便于插入。在光遗传学实验之前，每个光纤的激光功率都由功率计（PM100D和S142C，Shorlabs，USA）测量。

5.4 静息态功能磁共振成像和光遗传学功能磁共振成像实验的数据采集

用3.5%异氟醚麻醉诱导。腹腔注射右美托咪定（0.02 mg/kg）。然后滴2.5%利多卡因应用于和弦提供局部麻醉。这些动物被气管插管并放置在核磁共振兼容的支架上。然后将异氟烷降低到2%，并保持在这个水平，直到他们的头部被耳棒固定，牙齿用咬棒固定。腹腔注射一片潘库溴铵（0.2 mg/kg；TargetMol，美国），一种神经肌肉阻断剂，以减少小鼠的运动。值得注意的是，在光麻醉下动物的头部运动小于之前的研究（70）：回归头部运动参数前后的平均FD分别为1.24 ± 0.02和0.07 ± 0.002m，相当于体素大小的0.5和0.03%。Itpr2−/−与WT小鼠在回归前（P = 0.16）和回归后的平均FD均无显著性差异(P = 0.76）。用眼用软膏来保护眼睛。在整个实验过程中，动物使用小动物呼吸机（TOPO，肯特科学公司，美国）进行机械通气，速度每分钟80次呼吸，呼吸周期为吸入25%，呼气75%。值得注意的是，与自由呼吸相比，通气并没有导致小鼠的更高的平均心率，这表明由于我们的通气准备，应激水平没有增加。设置后，异氟醚减少并维持在0.4%，并开始持续皮下输注右美托咪定（0.04mg/kg/小时）以维持镇静水平。注意，我们的研究旨在结合光遗传功能磁共振成像光镇静和行为评估在清醒条件下，和我们的麻醉方案（0.04毫克公斤−1小时−1右美托咪定+ 0.4%异氟醚）已被证明保持稳定和健壮的诱发大胆反应和rsFC。动物的直肠温度保持在37±0.1°C，与MR兼容的加热器系统（加热器系统，小动物仪器，美国）。在整个实验过程中，使用MR兼容系统（美国小动物仪器公司）进行了连续的生理监测（直肠温度、呼吸频率、心率和氧饱和度）。上述小鼠的设置时间约为15 min。接下来的定位和解剖MRI扫描约需要15个min。在此期间，小鼠的生理状态逐渐稳定到正常范围（直肠温度：37±0.1°C，呼吸：80次每分钟80次，心率：350~420次/分钟，氧饱和度：>95%）。

所有的功能MRI实验都在Bruker 7T MRI扫描仪（Bruker BioSpin，德国）上进行，使用小鼠头部冷冻线圈（MRI冷冻探头，Bruker，德国）。解剖图像采集使用自旋回波（Turbo-RARE）序列[视场（FOV）= 16×16 mm2，矩阵= 256×256，RARE因子=8，重复时间（TR）/回波时间（TE）= 2500/35 ms，切片厚度= 0.4 mm]。利用预先扫描的场图，优化了ROI中的局部场均匀性。然后使用FOV =单镜头梯度回波平面成像（GE-EPI）序列获得功能数据，矩阵= 16×16 mm2，矩阵= 64×64，翻转角度=54.7°，切片厚度= 0.4 mm，假扫描=10，TR=TE=15 ms，TR = 750 ms（rsfMRI）或1000 ms（光遗传fMRI）。

在光遗传学实验中，我们使用了一个Arduino编程板来同步扫描仪触发器和光遗传学刺激激光器。蓝光通过473nm激光发射器通过光学片电缆（5至10 m）传输。光遗传刺激（10 Hz；光功率：光纤尖端3.5 mW；15%的占空比），持续时间为20 s。

5.5 rsfMRI和光遗传fMRI数据预处理

对于每一种动物，使用内部的自动脑提取算法对解剖图像和功能磁共振成像图像进行皮肤剥离，并在ITK-SNAP（www.itksnap.org/）中检查效果。使用SPM12（英国伦敦大学学院威康成像神经科学系）进行预处理。对功能图像进行切片定时校正，用6个刚体参数重新对齐，并进行配准和平滑（0.2mm各向同性高斯核）。在配准过程中，首先将功能图像配准与每只小鼠的解剖图像进行配准，然后利用对解剖图像和模板进行配准得到的变换矩阵对小鼠大脑模板（www.imaging.org.au/AMBMC/Model）进行配准。因此，fMRI图像被重新分割到一个具有相同分辨率和物理体素大小的公共组空间（最终分辨率：156×100×47体素，0.1×0.1×0.5 mm3）。共扫描了248次序列。其中，15个（6.05%）因运动伪影（>检测到0.5体素偏移）被排除，4个（1.61%）因呼吸模式的突然变化而被排除，4个（1.61%）因氧饱和度的突然变化而被排除。

5.6 rsfMRI数据分析

12个头部运动参数（滚动、俯仰、偏航、三维平移，以及这6个参数的一阶导数）从每个体素的时间序列中回归出来。随后是一个时态带通滤波（0.001到0.1 Hz）。预处理后的rsfMRI图像使用GIFT工具箱进行分解。nitrc.org/projects/gift/)。使用GIFT中实现的最小描述长度标准，发现所有rsfMRI数据的估计组件数为67个。丢弃14个组件与脑脊液、运动诱发或血管诱发伪激活，其余53个 ICA地图视觉检查和标记的基础上参考已知的解剖和功能位置，导致94标签的空间分离和左右对称的大脑单元对应于47个大脑区域。

计算每对大脑单位之间的皮尔逊CCs，以生成每只小鼠的两两相关矩阵。取左右ROI的CCs平均值，形成47个×47个相关矩阵。相关矩阵采用Fisher的z变换进行变换，便于比较。相关矩阵的组间比较采用双尾独立样本t检验和FDR多重比较校正。改变后的rsFC在BrainNet Viewer（www.nitrc.org/projects/bnv/）中可视化。效应量计算为组间均值的标准化差值（Cohen’sD）。通过NMI量化各脑区的整体连通性变化，计算为平均效应量。

对于SBA，选择右侧mPFC中一个图谱定义的4×4区域作为种子。通过使用MATLAB 2017b（MathWorks，USA）计算种子的时间序列和每个其他体素的BOLD信号之间的皮尔逊CCs，生成单个CC图。取每只小鼠所有重复阶段的CC图的平均值。每一组的平均CC图都是通过平均该组中所有小鼠的CC图来生成的。

5.7 光遗传功能磁共振数据分析

在光遗传刺激后的每一阶段，6个头部运动参数及其一阶导数从每个体素的时间过程中回归出来。然后，应用一个标准的一般线性模型来计算响应图，并使用SPM12中的P<0.01（fdr校正）阈值进行学生t检验来识别激活的体素。对于表达chr2的小鼠，只有那些在纤维尖端有明显BOLD激活的阶段被用于随后的SBA中。取各组所有小鼠的t图平均值，检测组水平上的BOLD激活。对于mPFC星形胶质细胞光遗传刺激的fMRI数据，进行二级单样本t检验分析，生成fdr校正的P < 0.05和聚类大小> 30体素的组激活图。

采用SBA法生成表达chr2和mcherry对照小鼠右侧mPFC的CC图。当诱发的BOLD信号已经恢复到基线时，仅使用刺激偏移40秒后获得的数据来计算刺激后各阶段的CC图。抑郁相关网络中的rsFC是利用同侧皮层中的ROI生成的。由于纤维植入引起轻微的伪影，在光遗传激活的mPFC神经元或星形胶质细胞的实验中，mPFC的ROI被纤维尖端的6×6体素所取代。然后用Fisher的z变换对CC值进行组间比较。

5.8 MDD患者的rsfMRI数据分析

从REST-meta-MDD联盟中获得了一个包含1276例MDD患者和1104例正常对照组的静息状态fMRI数据集。数据集使用DPARSF软件进行预处理，并在当地站点进行了标准化的管道。简单地说，在丢弃最初的10个体积后，对所有的fMRI图像进行切片时间校正，用6个刚体参数重新对齐，并进行时间滤波（0.01到0.1 Hz）。此外，从图像中回归出Friston-24头部运动参数、白质和脑脊液信号以及线性趋势，以减少头部运动混淆、生理噪声和BOLD信号漂移。最后，这些图像被注册到蒙特利尔神经学研究所（MNI）的空间。

该数据集包括来自中国25个研究地点的1276名MDD患者和1104名正常对照组。所有数据都被识别和匿名，相关研究也得到了当地机构审查委员会的批准。所有受试者在当地各机构签署知情同意书。组统计分析前控制数据质量的标准包括: (i)站点3、18、24的数据因预处理（肉眼检查）图像质量低而被排除，导致1196 MDD和1016 NC；（ii）97 MDD和75 NC因年龄小于18岁或大于65岁而被排除，导致1099 MDD和941 NC；（iii）10 MDD和6 NC被排除，因为扫描（目视检查）没有成像PFC或顶叶皮层，导致1089 MDD和935 NC；（iv）8 MDD和4 NC被排除，因为他们的图像没有注册到MNI空间（目视检查），导致1081 MDD和931 NC；(v) 1 MDD因图像显示枕叶结构异常而被排除。最后，从中国各地的21个研究地点共招募的1080名MDD和931名NC符合上述标准。为了控制头部运动对我们的研究结果的影响，我们在排除平均FD大于0.2或0.1 mm的受试者后重新进行了分析：即排除平均FD > 0.2 mm的受试者，导致1059 MDD和917 NC；排除平均FD > 0.1 mm的受试者，导致879 MDD和733 NC。

该数据集为我们提供了从人类图谱定义的ROI中提取的时间序列，而不是原始图像，这些ROI不包括DRN、SC和Hb区域。为了评估在Itpr2−/−小鼠中发现的抑郁相关网络中的rsFC改变（即mPFC、Str、AMY、TH、SsCx、VCx、Ant、SC、DRN和Hb的亚区域；图1C到E），我们使用这些脑区域的平均时间历程来计算除DRN-、SC-和Hb相关通路外的相应通路的rsFC。mPFC、Str、TH、SsCx、VCx和Ant的平均时间过程使用Dosenbach功能图谱生成。使用AAL图谱生成AMY的平均时间序列。这些人类图谱定义的ROI在MNI空间中的坐标。rsFC通过两个大脑区域的时间序列之间的平均皮尔逊CCs进行量化，然后转换为z分数。

我们使用LMM来评估抑郁症（这里是诊断）与rsFC的相关性。将人口统计学信息（即年龄、性别、受教育程度和头部运动）作为协变量加入到LMM中，以控制其混杂效应。这里的头部运动是由Jenkinson的相对均方根算法（32）导出的平均FD。LMM分析采用MATLAB函数“fitlme”进行,得到诊断固定效应的t和P值。值得注意的是，LMM包含特定于位点的随机效应和独立于位点的固定效应，这有助于控制潜在的系统位点相关混杂因素。FDR校正用于多重比较。效应量被计算为科恩的Cohen’s D。

在验证分析中，使用Craddock的功能聚类图谱生成每个大脑区域的平均时间序列。这些ROI在MNI空间中的坐标。

5.9 氯化锰管理、MEMRI数据采集和分析

氯化锰给药时，将5 nl氯化锰溶液（600 mM）注入WT和Itpr2−/−小鼠的mPFC中，用组织胶愈合头皮。所有小鼠在7T Bruker扫描仪上进行扫描，72毫米直径的体积线圈用于射频脉冲传输，10毫米直径的环形线圈用于信号检测。准备扫描大约需要30 min，因此在注射氯化锰后的0.5、4.5、8.5和24.5小时获得每只小鼠的动态MEMRI数据。为了在多次扫描中保持线圈定位一致，我们在每只小鼠的第一次扫描中标记线圈在头皮上的精确位置，并在氯化锰管理期间被剃光。在成像过程中，小鼠的头部被固定在一个带有咬合条和耳条的塑料支架中。老鼠用鼻子自由呼吸。麻醉维持在1%异氟醚，体温通过集成在塑料支架中的温水电路保持在36.5±0.5°C。我们使用t1加权三维快速低角度拍摄（闪光）序列翻转角度=35°，TR/TE = 35/4 ms，FOV = 16毫米×16毫米×10毫米，矩阵大小= 160×160×50，产生100×100×200体素。

4只小鼠的MEMRI数据因脑形态异常（WT：n = 1）和偏离mPFC（WT：n = 1；Itpr2−/−：n = 2）的注射位置而被丢弃。MR图像在ITK-SNAP中手动剥离头骨，并注册到小鼠大脑模板上。在个体水平上，每次扫描的图像强度都使用周围肌肉的图像强度进行归一化，这不应该受到Mn2+运输的影响。我们使用ImageJ（http://rsb.info.nih.gov/ij/）中的最大密度投影来追踪注射8.5小时后Mn2+的扩散。利用ITK-SNAP在模板空间中Mn2+的分布，绘制了6个ROI掩模（vStr、dStr、LGP、TH、AMY和VTA），每个掩模跨越三个连续的切片。然后将ROI掩模应用于每次扫描的归一化图像，提取平均MEMRI信号强度。

5.10 荧光免疫检验法

进行行为分析的动物被深度麻醉，经心脏灌注生理盐水，然后注射4%多聚甲醛（PFA）。取出大脑，在4°C下4% PFA下固定过夜，转移到磷酸盐缓冲盐水（PBS蔗糖，PBS；pH 7.4）中。三天后，使用冷冻切片机（德国徕卡CM1950）将大脑切成40m厚的切片。切片用0.1 M PBS洗涤3次，然后在含有5%正常山羊血清的封闭缓冲液中，在0.5% Triton X-100/PBS中室温孵育1.5小时。阻断后，切片与一抗在PBS中以4°C孵育过夜。使用的一抗是GFAP（星形胶质细胞标记物，1：300；细胞信号技术，3670S)和NeuN（神经元标记物，1：500；微孔，MABN140）。PBS洗涤三次后，切片与Alexa Fluor 488山羊抗小鼠（1：500；，R37120）或Alexa Fluor 488驴抗兔（1：500；，A21206）二抗在室温下孵育1小时。切片再洗三次。4′，6-二丁胺-2-苯林多尔（DAPI）用于荧光核复染。将盖子安装在载玻片上，并使用尼康C2共聚焦显微镜（日本）进行观察。

5.11 行为分析

       在行为测试中，小鼠被单侧将光纤（直径200μm，数值孔径= 0.37；中国）植入mPFC或vStr的感染细胞上。该光纤通过一个光纤套管连接到一个激光光源（Inper B1465，中国）。在光遗传刺激过程中，20秒的蓝光（473 nm，10 Hz，15%的占空比）被传递为3.5 mW。在习惯化后进行行为测试。用共聚焦图像检查所有小鼠的纤维位置，确保用于进一步分析的数据来自于纤维位置正确的小鼠。

5.12 尾悬试验

在光遗传刺激后，这些小鼠被转移到家笼子中休息一分钟。然后，将老鼠绑在离尾巴尖端1厘米的地方，然后悬浮在一个水平杆上，悬浮时它们的头部离表面约15厘米。使用小鼠尾巴悬液（MED-TSS-MS，USA）记录5分钟内的静止状态。

5.13 强迫游泳试验

FST是在一个45厘米×19厘米的透明玻璃瓶中进行的，里面充满了水，高为23厘米（23°至25°C）。试验前48小时进行4 min预冲洗。通过视频跟踪系统（EthoVision XT 11.5，Noldus，荷兰）记录了4分钟内的静止状态。在光遗传学试验中，在光遗传学刺激后，将小鼠转移到家笼中休息1分钟，然后记录4min内的静止时间。

5.14 蔗糖偏好测试

小鼠习惯于60毫升的活塞管（两瓶选择）装满饮用水2天。在习惯化后，小鼠接受光遗传刺激，然后被给予一瓶水和一瓶1%蔗糖溶液24小时。装有水和蔗糖的瓶子在第一天12点和18点称重，在第二天12点称重。在每次测量液体重量后，瓶子的位置被切换，以确保小鼠不会产生位置偏好。每只小鼠的蔗糖偏好计算如下：蔗糖偏好（%）= 100×（蔗糖总消耗量/水和蔗糖总消耗量）。在mPFC-Str投射的光遗传激活的行为测试中，一只表达chr2的Itpr2−/−小鼠的数据被排除在外，因为这只小鼠有位置偏好。

5.15 露天测验

露天装置由一个矩形腔室（40厘米×40厘米×30厘米）组成，它由灰色聚氯乙烯制成。将小鼠轻轻放置在中心，并允许其自由探索5 min。在光遗传学实验中，自由探索时间为9 min，刺激、刺激和刺激条件各为3 min。存储每只小鼠所拍摄的路径的数字化图像，并使用EthoVision 7.0软件分析其运动活动。

5.16 体外电生理学

小鼠被异氟醚麻醉并被斩首，大脑被迅速移除。将大脑快速置入冰冷修饰的人工脑脊液（ACSF）中，其中含有250 mM蔗糖、26 mM碳酸氢钠、10 mM葡萄糖、10 mM硫酸镁、2 mM氯化钾、1.3 mM磷酸二氢钠和0.2 mM氯化钙。含有mPFC（300μm）的切片在冰冷修饰的ACSF中制备，使用VT-1200S振动组（徕卡，德国），转移到含有常规ACSF的储存室，其中包含126 mM氯化钠，26 mM碳酸氢钠，10 mM葡萄糖，3 mM氯化钾，2 mM氯化钙，1.25 mM磷酸二氢钠，和1 mM硫酸镁，在34°C下恢复30 min，然后在室温（25±1°C）下恢复1小时后记录。在切片制备过程中，所有溶液均用95% O2/5%二氧化碳（v/v）饱和。

将脑切片置于记录室中，以2 ml/min的流速连续灌注ACSF。mCherry+细胞的全细胞膜片钳记录在尼康月FN1显微镜（尼康）下观察，该显微镜配备40×水浸镜头，并用汞灯照明。在光遗传学实验中，在放大器的数字输出控制下，用智能光源（Inper，中国）产生的473nm蓝光脉冲激活表达chr2的体细胞。移液管电阻范围为3到5兆欧。胞内溶液包含140mMK-葡萄糖酸盐，9 mM Hepes，4.4 mM磷酸肌酸二钠，4 mM三磷酸腺苷-Mg，4.5mM氯化镁，0.3 mM三磷酸鸟苷和5 mM EGTA，290至300 mOsm（pH 7.2-7.3），用氢氧化钾调整。数据使用EPC 10放大器（HEKA电子公司，德国）获取，用贝塞尔滤波器在2.9 kHz进行滤波，在10 kHz进行数字化，并使用pClamp10.2软件（分子设备，美国）进行分析。

5.17 统计分析

所有统计分析均采用SPSS 22.0进行。除有说明外，使用Shapiro-Wilk检验确认数据为正态分布。正态分布数据采用单因素方差、双向方差和双向重复测量方差检验，然后采用Sidak多重比较。我们使用独立样本t检验来比较Itpr2−/−和WT小鼠之间的rsFC。我们使用LMM来比较MDD患者和正常对照组之间的rsFC，并将人口统计学信息（即年龄、性别、教育程度和头部运动）加入LMM作为协变量，以控制其混杂效应。统计学意义分别为*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。