shRNA和siRNA

shRNA和siRNA的区别

RNA干扰(RNAI)是有效沉默或抑制目标基因表达的过程，该过程通过双链RNA (dsRNA)使得目标基因相应的mRNA选择性失活来实现的。RNA干扰由转运到细胞细胞质中的双链RNA激活。沉默机制可导致由小干扰RNA (siRNA) 或短发夹RNA (shRNA)诱导实现mRNA的降解，或者通过小RNA (miRNA)诱导特定mRNA翻译的抑制。这篇综述将重点介绍shRNA和siRNA是如何导致蛋白质表达抑制的。通过几种蛋白的活性(下面讨论)，通过短反义核酸(siRNA和shRNA序列) 锁定细胞mRNA,从而实现其随后的降解。这反过来阻断了该蛋白的进一步表达/聚集， 导致其水平的下降，最终实现抑制作用。

早在1984年人们就发现反义RNA能够抑制基因的表达。1993年， Nellen和Lichtenstein提出了一个模型来解释这个观察。然而，直到1998年， Fire等人发表了 在线虫RNA干扰的结果，他们发现双链RNA在抑制基因表达方面实际上比单链RNA更有效。最终确定小RNA途径涉及的蛋白质组分有许多与RNA干扰途径一样。

siRNA Vs. shRNA作用机制

两个在RNAi途径的基因沉默中具有实质利害关系的是双链小干扰RNA (siRNA) 和基于载体的短发夹RNA (shRNA)。虽然siRNA和shRNA (图1) 都可用于蛋白沉默，但它们的作用机制有所不同(图2) .不管是长的双链RNA还是短的约21bp碱基对的双链都能够直接披转运到组织培养的细胞中(参见转运机制获取更多细节)。虽然有一些报道提到siRNA在转染细胞时是 被转运到细胞核中的，但更普遍的看法是它们在细胞质中聚集。长的双链RNA与Dicer-起形成复合物， 双链特异性的核糖核酸酶1川能够将它们处理成带有两个游离碱基的长度为21-23nt的siRNA.随后这些siRNA片段与RISC结合，RISC由Argonaute-2(Ago-2)、Dicer和TAR-RNA结合蛋白(TRBP) 组成。然后RNA的两条链分开，其中一条链从复合物上分离。5端双链稳定性最低的那条链被选择出来，稳定的并入沉默复合物中。
Drosha加工然后由Exportin-5蛋白转运到细胞质中，在细胞质中它们与Dicer结合去除环状序列。在这一点上，它们与siRNA的加工方式(以短的双链形态导入细胞，然后被Diceri识别)相同。在与RISC结合并去掉其中条RNA链后，它们识枫丹壹号别mRNA占有互补序列，导致其降解。shRNA在转染/转导细胞的细胞核中的合成，形成发夹结构，茎区成对的反义和正义链与未配对的成环核苷酸连接在一起(图1b和1c) .通过与miRNA的加工相同的RNAi机制，shRNA被加工成siRNA.使用细菌
或病毒载体，shRNA被导入靶细胞的细胞核内，在某些情况下，载体可以稳定地整合到基因组中。根据驱动表达的启动子的不同，shRNA可被RNA聚合酶1或者川I催化转录。在被Exportin-5转运到细胞质之前，这些初始的前体结构需要首先用Drosha及其双链RNA结合伴侣DGCR8加工形成pre-shRNA. pre -shRNA随后被Dicer和TRBP/PACT酶切，去除发卡结构，产生在两个3‘末端带有两个游离碱基的20-25nt的双链siRNA.这一有活性的siRNA随后被整合到沉默复合物上去。一旦被整合到RISC后，shRNA和siRNA识别靶mRNA和降解的过程基本上是相同的。作为RISC的一部分,siRNA通过碱基互补配对以序列特异性的方式结合到mRNA,从而利用Ago-2的核酸酶H样活性裂解靶RNA的双链中心附近的磷酸骨架。某些生物的这个系统有一个有趣的特点，siRNA与靶mRNA的退火使siRNA作为引物，而靶mRNA作为依赖于RNA的RNA聚合酶的模板。这就合成出一个新的双链RNA,然后由Dicer酶加工，形成正反馈循环，增加了siRNA的量.应当指出的siRNA通常需要完全同源才能诱导降解。人们对RISC发现靶mRNA的过程还没有很好的理解。然而，Ameres等的报告显示细胞mRNA的靶序列的亲近性影响了它的剪切。他们还指出，RISC不是作用于未折叠的RNA.他们提出了一个模型，在该模型中，RISC非特异性的方式通过随机扩散与单链RNA接触，5’末端碱基配对比3’末端更有效率。这似乎决定了RISC与靶mRNA的稳定结合。shRNALsiRNA的优势包括能够使用病毒载体进行转染，克服了某些类型的细胞不能转染的难题，能选择使用诱导型启动子控制shRNA表达，能够与报告基因共表达。此外，它们能减少脱靶效应。

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