imputation-文献：False signals induced by single-cell imputation（scRNA-seq插补引入的假阳性问题）

文章题目

False signals induced by single-cell imputation

中文名：

单细胞插补引起的假信号

文章地址：
https://f1000research.com/articles/7-1740/v2

评价插补方法：

SAVER,DrImpute,scImpute,DCA,MAGIC,knn-smooth

上述方法基于原理不同
SAVER，scImpute，drImpute基于模型，knn-smooth和MAGIC基于高斯平滑的思路，DCA是一种使用自编码器的基于深度学习的方法

评价指标构造方法：

1.构造简单的负二项数据集

1000个细胞 500个基因（平均表达确定在一个区间水平内） 细胞类型2类

数据集中不存在dropout现象（没有0值）
数据集中基因 一半处于差异表达状态 另外一半独立绘制 不存在差异表达
鉴定方法：通过SPearman相关性鉴定细胞间相关性，相关性确定后，用Bonferroni矫正相关性

假阳性设定：

不涉及DE基因或方向不正确的相关性被视为假阳性

结果

结果说明

所有插补方法都提高了检测低表达DE基因相关性的敏感性。然而，只有SAVER增强了低表达DE基因之间的相关性，而没有在独立绘制的基因之间产生假阳性基因相关性。

2.构造基于Splatter的数据模型

生成60个模拟scRNA-seq矩阵matrix

模拟数据集中的DE差异基因占比和dropout率各不相同，此外
每种方法的组也不相同

通过测试各组之间的差异表达基因来评估插补带来的假阳性可能
使用Kruskal Wallis检验来验证插补后数据的分布是否出现变化

真正的差异表达基因定义为：

gene大小为所有成对簇的最大对数2倍变化且在5%FDR后显著的基因才被称为DE gene

假阳性设定

构造的splatter数据集本身具有不同数据的原始值 设定为reference 这个值可以作为ground truth使用
插补前后的数据集本身的DE gene 与真实情况的出入视为假阳性和假阴性来源

结果

结果解读

总的来说，当同时考虑敏感性和特异性时，基于模型的方法比平滑方法表现更好

3.对Tabula Muris数据集进行插补改装

从Tabula Muris中选择了6个10X 12个Smart-seq2的数据集

1.首先做归一化：

至少有两种细胞类型含有>5%的总细胞数目，过滤后有500-5000个细胞（表S1）。对每个数据集进行预处理，以删除占总细胞数小于5%的细胞类型，以及未分配给命名细胞类型的任何细胞。对基因进行过滤，以去除在不到5%的细胞中检测到的基因。

2.然后基于欧氏距离选择每种数据集中最相近的两个细胞类型

3.随后在选定细胞类型中计算基因差异表达

4.应用Mann-Whitney-U检验测试两种选定细胞类型之间的差异表达，评估每个插补引入的假阳性。采用Bonferroni多重检测校正，以确保预期总误报率低于1

5.留下不差异表达的基因，对其进行插补去噪

假阳性设定

插补去噪后进行上述步骤，差异表达基因如果存在即代表假阳性出现。

结果

结果解读

同一种方法在不同数据集上假阳性可能性不同。

4.构造可再现性的marker指标

上一步骤讲述的Tabula Muris数据集在该步骤继续使用
通过Mann-Whitney-U检验方法来确定标记基因Marker
Marker gene是一种不同于DE gene的指标 每一个gene都会被分配一个自己的marker所属细胞类型
判定标准：将基因分配给AUC值最高的细胞类型
使用5%的FDR和超过特定阈值的AUC为每个输入数据集定义重要标记基因

通过这种方法可以将每个基因分配给数据集中的单个细胞类型 而不是全局细胞类型

假阳性设定

设定为marker的gene在插补后是否是可再现的
可再现性分数定义为：
在两个数据集中都是显著标记的、也是同一细胞类型标记的标记的分数

结果

结果解读

存在大量的不可重现的标记marker gene 说明在不同数据集中的可定义为某个细胞类型的marker其实是有差别的。同一个marker gene在不同的数据集中属于不同的细胞类型。
如果不进行插补，两个数据集中95%的显著标记基因在同一细胞类型中高度表达。插补后，根据AUC阈值（可以划归为marker的阈值）的升高，这一数字大幅下降。在估算的Smart-seq2和10X Chromium数据集中，降低幅度阈值会导致更多标记分配给相互矛盾的细胞类型。

未经插补过的数据实际上获得了最高比例的一致性marker

插补之间的marker存在矛盾，同一个数据集中，通过不同插补方法分配给不同细胞类型的重要标记（FDR 5%）的比例亦不相同。
根据所用的插补方法，总共有5-35%的markergene 分配给不同细胞类型。
且存在偏向性 一部分属于MAGIC、SAVER和dca，另一部分属于scImpute、DrImpute和knn-smooth。

同样的数据集经过不同的插补方法处理后，同一数据集的两种不同细胞（红，蓝）出现了DE基因的假阳性变化。例如，使用MAGIC插补后，Zfp606在PP细胞中的表达高于A细胞，但使用knn光滑插补后则相反。

总结

• 1.各类插补方法都会导致假阳性无可避免的存在
• 2.平衡sensitivity和specificity之间的基本平衡不可靠插补来打破
• 3.真实数据集相比于仿真数据集(splatter)变化更多，一些本来不会产生假阳性的方法在真实数据集上还是会产生假阳性
• 4.不同的插补方法既有利于敏感性，也有利于特异性，但没有一种方法能够全面改善差异表达的检测
• 5.当前单细胞RNASeq插补方法的基本局限性，即仅使用原始数据中的信息。因此，没有获得新的信息，这类似于简单地降低应用于数据的任何统计检验的显著性阈值
• 6.验证多个数据集或多个插补方法的结果再现性可以消除一些假阳性。