赛思基因(www.scientsgene.com),专注遗传转化技术的应用于开发,致力于打破基因型限制,助力基因编辑育种。
题目:Specific and multiple-target gene silencing reveals function diversity of BnaA2.NIP5;1 and BnaA3.NIP5;1 in Brassica napus
期刊名:Plant Cell Environ (IF=7.228)
作者:Mingliang He, Fangsen Xu
单位:华中农业大学
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摘要
油菜籽 (Brassica napus) 是世界上重要的油料作物,但其生长在很大程度上依赖于硼(B)的供应。内在蛋白NIP5;1对硼缺乏下的硼吸收和植物的发育至关重要。在本研究中,系统发育和表达分析确定了两个 NIP5;1的直系同源基因BnaA2.NIP5;1和BnaA3.NIP5;1的功能。多靶点RNAi分别用于抑制BnaA3.NIP5;1或BnaA2.NIP5;1在B高效利用油菜品种QY10中的表达,以揭示BnaA2.NIP5;1 和 BnaA3.NIP5;1的作用。我们发现 BnaA2.NIP5;1 和 BnaA3.NIP5;1 在低 B 条件下对欧洲油菜的正常生长都很重要,而这两个基因具有不同的作用。BnaA2.NIP5;1 主要在表皮细胞中表达,这是有效吸收硼进入根部所必需的。BnaA3.NIP5;1特异性定位于侧根细胞的远端部分以促进低硼条件下的主根伸长,这对欧洲油菜成熟期的种子生产很重要。总之,我们的多靶点RNAi策略为BnaA2.NIP5;1和BnaA3.NIP5;1之间的基因功能多样化提供了新的见解,这种方法可能适用于其他多倍体作物。
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技术路线
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主要结果
3.1 NIP5;1在陆地植物中的进化史
从19种不同的陆地植物中鉴定并检索了NIP5;1的氨基酸序列。NIP5;1氨基酸序列的系统发育分析,得到了与陆地植物主要谱系之间的关系的基因树(图 1a)。结果显示 NIP5;1 存在于所有主要的陆地植物中,所有 NIP5;1基因都从一个共同的祖先分化(图 1a)。我们在基础被子植物 Amborella trichopoda、双子叶葡萄和拟南芥基因组中发现了一个 NIP5;1 基因(图 1b)。在油菜和甘蓝基因组中发现了两个 NIP5;1 基因和五个 NIP5;1 基因(BnaA2.NIP5;1、BnaA3.NIP5;1、BnaA7.NIP5;1、BnaC2.NIP5;1 和 BnaC3.NIP5 ;1)。这可能是由于多倍体后发生的大量基因丢失。比较序列分析显示,BnaA2.NIP5;1、BnaA3.NIP5;1、BnaA7.NIP5;1、BnaC2.NIP5;1和BnaC3.NIP5;1基因与 AtNIP5;1 的氨基酸同一性分别为93.8%、92.4%、89.5%、92.8%和92.4%。
3.2 BnaA2.NIP5;1和BnaA3.NIP5;1基因的表达模式
之前的研究中,通过RNA测序分析了 QY10对 B 缺乏的转录反应。我们发现 BnaA2.NIP5;1 和 BnaA3.NIP5;1在QY10的根中高表达,而另外 3 个基因 BnaA7.NIP5;1、BnaC2.NIP5;1 和 BnaC3.NIP5;1 在两个根中都低表达 和芽(图2a)。我们通过qRT-PCR进一步研究了QY10根中BnaNIP5;1基因的表达水平。与 RNA 测序结果一致,qRT-PCR 显示 BnaA2.NIP5;1 和 BnaA3.NIP5;1 在根中高表达并受B缺乏诱导,其他三个基因在高 B 和 低 B 条件(图 2b)。
3.3 转基因植株的获得和基因表达量分析
采用RNAi技术抑制BnaA2.NIP5;1和BnaA3.NIP5;1的表达来研究这两个基因在QY10中的作用。将敲除载体 sRNAi BnaA3.NIP5;1 和 mRNAi BnaNIP5;1转化到QY10中以产生BnaA3.NIP5;1特异性 RNAi,以及 BnaA2.NIP5;1 和 BnaA3.NIP5;1 RNAi 转基因植物,分别命名为 QsRNAi 和 QmRNAi。选择三个独立的 QsRNAi 和 QmRNAi 转基因 T2 代系,通过 qRT-PCR 分析 BnaA2.NIP5;1 和 BnaA3.NIP5;1 在根中的表达水平。结果表明,与野生型 QY10 相比,QsRNAi 和 QmRNAi 转基因植物中 BnaA3.NIP5;1 的表达均显着降低(图 4a)。与野生型 QY10 相比,QmRNAi 转基因植物中 BnaA2.NIP5;1 的表达显着降低,而在 QsRNAi 转基因植物中未观察到变化(图 4b)。这些结果表明,BnaA3.NIP5;1 的表达水平在 QsRNAi 转基因植物和 BnaA2 中特异性降低。
3.4 QsRNAi 和 QmRNAi 转基因植物对 B 缺乏的反应
为了研究 BnaA2.NIP5;1 和 BnaA3.NIP5;1 在欧洲油菜中的作用,野生型 QY10、QsRNAi 和 QmRNAi 转基因植物在高 B(100 μM ) 或低 B (0.25 μM) 条件下培养15天。在低B条件下,QsRNAi转基因植物表现出严重的发育缺陷,包括弯曲的叶子和粗短的根,而QmRNAi转基因植物表现出严重的缺陷,包括顶端分生组织中的多个分枝和坏死(图5b),所有这些都是典型的 B 缺乏症状。然而,它们的生长在高 B 条件下变得正常(图 5a)。在高B条件下,野生型 QY10、QsRNAi 和 QmRNAi 转基因植物的枝条干重、根干重和初生根长度没有差异(图 5c-e)。然而,在低 B 条件下,与野生型 QY10 相比,QsRNAi 转基因植物的枝条干重、根干重和初级根长度显着降低(图 5c-e)。此外,与 QsRNAi 转基因植物相比,QmRNAi 转基因植物的枝条和根干重显着降低(图 5c,d),而 QsRNAi 和 QmRNAi 转基因植物的主根长度没有差异(图 5e)。这些结果表明,BnaA2.NIP5;1 和 BnaA3.NIP5;1 在低 B 条件下对欧洲油菜的生长发育很重要。
3.5 BnaA3.NIP5;1对欧洲油菜B限制条件下的种子生产至关重要
为了进一步研究 BnaA3.NIP5;1 在欧洲油菜生殖发育中的作用,我们评估了QsRNAi转基因植物和野生盆栽下QY10型。在低 B 条件下,与野生型 QY10 相比,在 QsRNAi 转基因植物中观察到更少的种子和更多的空荚(图 6b-d)。与野生型 QY10 相比,QsRNAi 转基因植物的豆荚数和每个豆荚的种子数量均显着减少(图 6f,g),导致每株种子产量下降 85% 以上(图 6e,h) .然而,QsRNAi 转基因植物和具有高 B 供应的野生型 QY10 之间的生产性能相似(图 6a,d-h)。这些结果表明,BnaA3.NIP5;1对B限制条件下欧洲油菜的种子生产至关重要。
3.6 BnaA2.NIP5;1 控制根对B的吸收
BnaA2.NIP5;1 和 BnaA3.NIP5;1 主要在根组织中表达(图 2a)。我们通过RT-PCR 进一步研究了 BnaA2.NIP5;1 和 BnaA3.NIP5;1 表达的细胞特异性。结果显示,与阴性对照(无RT)相比,BnaA2.NIP5;1的表达主要在分裂区和伸长区的表皮细胞中检测到(图7a,b)。在欧洲油菜中,我们使用 B、10B 和 11B 的稳定同位素进行了短期标记实验。野生型QY10、QsRNAi和QmRNAi转基因植物的幼苗用25 μM 正常B预培养15 d,然后暴露于不含B的溶液中1 d,随后将植物暴露于10 μM 同位素B 1 h。结果表明,QsRNAi转基因植物和野生型QY10(图7c,d)以及10B吸收和转移(图7e,f)的10B浓度在芽和根中没有差异。与野生型 QY10 相比,QsRNAi 和 QmRNAi 转基因植物的枝条 11B 浓度和根部 11B 浓度均无差异。
这些结果表明在表皮细胞中表达的BnaA2.NIP5;1参与了B在根中的吸收,并有助于B在低B条件下向地上部的分布。
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