一文带您了解亚细胞定位(Subcellular Localization)

亚细胞定位是理解蛋白质功能的关键步骤,本文介绍了亚细胞定位的定义、意义,以及使用烟草作为模型进行亚细胞定位的详细步骤,包括融合报告基因定位法。同时,讨论了预测工具和实验中可能遇到的问题,如定位位置判断困难及拍摄明场通道的重要性。赛思基因提供专业亚细胞定位服务,助力基因编辑研究。
摘要由CSDN通过智能技术生成

一文带您了解亚细胞定位(Subcellular Localization)

01

什么是亚细胞定位

成熟蛋白质必须在特定的亚细胞器里面才能发挥稳定的生物学功能。细胞内部可以进一步划分为不同的细胞区域或细胞器,即亚细胞。常见的亚细胞有细胞核、细胞膜、内质网、高尔基体、细胞质、线粒体、叶绿体等(图1)。每种亚细胞中都存在一组特定的蛋白质,亚细胞结构为这些蛋白质行使功能提供了相对独立的生命活动场所。同时也只有在相同或相近的亚细胞位置上蛋白质间才会有相互作用。

图1 细胞结构

为准确了解某种蛋白功能,除需对其蛋白结构进行分析外,通常还需清楚其亚细胞定位,以此判断其发挥功能的可能场所。蛋白质亚细胞定位对研究蛋白质的功能非常重要。

亚细胞定位可将某种蛋白或者表达产物定位于细胞中的具体位置,如细胞核内、各种细胞器以及质膜上,从而为理解基因的作用机制提供研究方向。目前研究亚细胞定位最常用的是融合报告基因定位法,将目标蛋白与荧光蛋白的N端或者C端融合,通过瞬时转化技术或稳定遗传转化技术,使得该融合蛋白在受体材料细胞内表达,目标蛋白会牵引荧光蛋白一起定位到目标细胞器,在扫描共聚焦显微镜的激光照射下会发出绿色荧光,从而可以精确地定位蛋白质的位置。

02

烟草亚细胞定位的方法

1)挑取单克隆于5 ml LB液体培养中,28~30°C震荡培养。通常,LB中加入100 μg/ml 庆大霉素(农杆菌株GV3101携带抗性),50 μg/ml 大观霉素(载体携带)。

2)将1 ml 过夜培养的农杆菌转接到25 ml LB液体培养基中(加有与1相同的抗生素,另外加入高压灭菌的乙酰丁香酮)。

3)检测过夜培养的菌液OD600的值。

4)5000 g,15分钟集菌,用重悬液重悬菌体,最终OD600为0.4。

5)室温放置2~3 h后注射烟草。

6)将侵染液装入5 ml 注射器内,用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内(勿使用子叶)。注射后,烟草叶片会出现湿润的现象。

7)注射后2-5天,在便携式长波长紫外灯下检测GFP荧光信号(只适用于荧光很强的叶片)。

8)通过荧光显微镜或者激光共聚交荧光显微镜检测GFP信号。同时,可以提取蛋白,检测蛋白的含量。

03

常见问题

1)还有什么手段进行亚细胞定位?

常用一些在线工具对蛋白亚细胞定位进行预测分析辅助于实验,这样就能省时省力节约成本。下面推荐几个常用的工具:

1. WoLF PSORT II 亚细胞定位预测工具https://www.genscript.com/wolf-psort.html?src=leftbar

2. iPSORT亚细胞定位预测工具

http://ipsort.hgc.jp/

3. cNLS Mapper 核定位信号预测工具

http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi

4. SignalP 4.0 Server 信号肽和信号肽剪切位点预测工具

http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/

2)为什么有的普通定位结果出来后无法准确判断其定位位置?

细胞中的细胞器复杂且多样,除一些常见的、特征比较明显的细胞器外,有些细胞器在激光共聚焦下形状比较相似,例如:线粒体、过氧化物酶体、高尔基体等细胞器,它们的荧光表达形状可能都是点状,因此不易区分。这时可以结合基因的其他功能研究来判断其可能表达的位置。另外,蛋白表达本身也是一个复杂的过程,涉及到多个合成场所及转运过程,自身表达情况可能比较复杂,因此不易判断具体的表达位置。

3)拍摄时为什么有明场通道?

显示细胞状态,有活力的原生质体细胞应该是饱满圆润的,变形或破碎的细胞说明此时细胞不是最适状态或细胞已死亡;显示荧光确实是细胞内蛋白表达的,而不是细胞碎片及杂质产生的杂光。

赛思基因拥有完善、成熟的亚细胞定位体系,可随时进行转化和亚细胞定位实验。

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赛思基因(www.scientsgene.com),专注遗传转化技术的应用于开发,致力于打破基因型限制,助力基因编辑育种。

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