pET-28a(+)是什么，怎么看？-实验操作系列-1

01 典型的pET-28a(+)质粒遗传图谱

02 元件解读

Origin复制子：ColE1/pMB1/pBR322/pUC ori——起始载体的复制；f1 ori——f1噬菌体复制子，显示正义链合成方向。The origin of replication，由复制起始位点和相关调控元件组成，pET-28a(+)中的复制子属于松弛型中低拷贝型复制子，目标蛋白的高表达会对宿主菌造成较大的压力，所以表达载体的拷贝数通常较低。这个元件确定整个质粒的大方向，与MCS密切相关。

KanR：编码氨基糖苷磷酸转移酶，在原核细胞中产生卡那霉素抗性，在真核细胞中产生遗传霉素筛选标记。

Rop：编码ROP蛋白 ，使得质粒维持低拷贝水平，将质粒的拷贝数维持在15-20，该元件缺失会导致质粒拷贝数升高。

乳糖操纵子元件——lacI promoter+ lacI (启动阻遏蛋白的表达，是lac operator的抑制因子)，lac operator（lac操纵基因，阻遏蛋白与之结合后抑制其后基因的表达，使T7 RNA聚合酶无法与与启动子结合以及向下转录，从而关闭下游基因的表达。乳糖类似物IPTG可与阻遏蛋白结合从而失去对lac operator的控制，进而使得其后基因正常表达）。

T7 promoter：受控于T7 RNA聚合酶的启动子，是当今大肠杆菌表达系统的主流。 强大的T7启动子完全专一受控于T7 RNA聚合酶，而高活性的T7 RNA聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍，当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白。

6xHis（6xHis亲和标签）：MCS区C端和 N端各有一个，编码6个连续的His，用来作为纯化目标蛋白的标签。

throbin site：Thrombin蛋白酶切位点，蛋白序列为LVPRGS，用凝血酶处理纯化的蛋白可以将融合蛋白的目的蛋白和分目的蛋白分开。

T7 tag：提升翻译效率，T7噬菌体编码的蛋白p10前导序列的11个氨基酸，序列为MASMTGGQQMG，该标签可以被T7 tag标签抗体特异性识别。

MCS：多克隆位点区域，头部为BamHI、EcorI等酶切位点，尾部为XhoI、HindIII等酶切位点。

T7 terminator：受控于T7 RNA聚合酶的终止子。

03 MCS

具体我们要关注限制性内切酶活性，如下图，注意右边是头，左边是尾！

04 总结

带温度标记的质粒图谱详见下载文件，祝PCR顺利！ pET 系列载体通用引物

T7-F（5-‘TAATACGACTCACTATAGGG-3’）和

T7-R（5‘-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’）

短一点也可以，退火温度45℃

T7：TAATACGACTCACTATAGG

T7t：GCTAGTTATTGCTCAGCG