蛋白表达技术与毕赤酵母表达系统的介绍与应用-实验操作系列-7

蛋白表达技术与毕赤酵母表达系统的介绍与应用

蛋白表达是利用宿主细胞（如细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞或植物细胞）表达外源基因蛋白的分子生物学技术，是基因工程的重要组成部分。作为一种高效表达工具，毕赤酵母表达系统以其低成本、高产量和具备一定翻译后修饰功能等优点，受到越来越多的关注和应用。

一、毕赤酵母表达系统的特征

酵母表达系统的分类

酵母表达系统主要包括：

• 酿酒酵母表达系统

• 甲醇酵母表达系统（包括毕赤酵母）

• 其他酵母表达系统

毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母，能够以甲醇为唯一碳源生长[1]。相比于其他表达系统，毕赤酵母表达系统具有以下优势：

毕赤酵母表达系统的优势

1. 强大且精确的启动子调控 毕赤酵母的 醇氧化酶基因 AOX1 启动子 是目前已知最强、调控机制最严谨的启动子之一，可有效实现外源基因的高水平表达[1]。

2. 翻译后修饰功能 毕赤酵母能够进行磷酸化、糖基化等真核翻译后修饰，使其成为不可多得的真核表达系统。

3. 灵活的表达模式 可以实现蛋白在细胞内表达或分泌到细胞外，便于下游纯化[1]。

4. 培养成本低，生长快速 毕赤酵母培养条件简单、培养基廉价，同时其细胞生长速度快，非常适合大规模工业发酵。

5. 遗传稳定性高 外源基因可以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合到酵母染色体中，伴随染色体复制，表现出极高的遗传稳定性[2]。

6. 适合高密度培养 毕赤酵母可以进行高密度发酵，非常适合重组蛋白的工业化放大生产。

二、毕赤酵母表达系统的常用菌株类型

毕赤酵母的宿主菌常见类型包括 X33、GS115、KM71H 和 SMD116[3]，其具体特性如下：

菌株	表型	特点
X33	Mut+	野生型菌株，甲醇利用正常，适合广泛表达需求。
GS115	Mut+	HIS4 营养缺陷型，甲醇利用正常，适用于常规酵母转化方法。
KM71H	Muts	AOX1 位点被 ARG4 插入，甲醇利用缓慢型，适合优化蛋白表达。
SMD116	his4 pep4	蛋白酶缺失型，能减少因蛋白降解引起的表达产物不均问题，但生长速度较慢，产量偏低。

三、毕赤酵母表达载体的类型及特征

毕赤酵母表达载体以 整合型载体 为主，常见载体可分为 胞内表达载体 和 分泌表达载体：

1. 胞内表达载体 如果外源蛋白是细胞内非糖基化蛋白，则适合使用胞内表达载体，如 pPICZA 和 pPIC3K。

2. 分泌表达载体 如果外源蛋白需要分泌到细胞外，或者需要进行糖基化修饰，则适合分泌表达载体，如 pPICZαA 和 pPIC9K。分泌表达载体通常使用酿酒酵母的 α 交配因子信号序列 引导蛋白的正确分泌[1]。

载体特征： 这些载体通常包含 AOX1 启动子 和 终止子，以及选择标记基因（如 HIS4）。在特定宿主菌株中，通过载体和宿主染色体的单交叉事件实现外源基因整合（图2）。

四、毕赤酵母表达外源蛋白的方法步骤

毕赤酵母表达外源蛋白的基本流程如下：

1. 表达质粒线性化 使用酶（如 SacI 或 PmeI）在线性化表达质粒，确保目的基因能正确插入到毕赤酵母基因组的 AOX1 区域。

2. 制备感受态细胞并电转 将处理后的质粒通过电转方法导入毕赤酵母细胞。电转条件一般为 1500V 电压、400Ω 电阻和 25μF 电容。

3. 转化子筛选和验证 将转化后的酵母涂布在含抗性筛选的培养基上，通过 PCR 验证转化子的正确性。

4. 蛋白表达诱导 将转化子培养到适宜密度后，通过添加甲醇诱导蛋白表达，取样并检测不同时间点的表达量（如 SDS-PAGE 分析）。

5. 蛋白提取与纯化 如果是胞内蛋白，则通过高压均质破碎酵母细胞后进行纯化；如果是分泌蛋白，则直接从培养上清中提取。

五、毕赤酵母在实际中的应用与前景

近年来，毕赤酵母已经成功表达了多种蛋白质，表现出极高的效率和灵活性。典型应用包括：

• 工业酶：如 α-淀粉酶、纤维素酶等。

• 生物医药：如肿瘤坏死因子（TNF）和疫苗抗原蛋白。

• 美容护肤：用于生产胶原蛋白等功能性蛋白。

毕赤酵母表达系统以其高产量和低成本的优势，在生物医药、工业酶制剂以及美容护肤领域展现了广阔的应用前景。未来，随着基因工程和合成生物学技术的进步，毕赤酵母有望在更广泛的领域中发挥更大的作用，为人类健康和工业发展贡献更多力量。