酿酒酵母表达系统与毕赤酵母表达系统的比较--实验操作系列-8

酿酒酵母表达系统与毕赤酵母表达系统的比较

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酵母作为一种单细胞低等真核生物，因其培养简便、繁殖快速以及基因操作方便等优点，逐渐发展为重要的外源基因表达平台。其中，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 和 毕赤酵母（Pichia pastoris） 是最常用的两种酵母表达系统。二者各有特点，在生物医药、工业酶制剂和基础研究中发挥了广泛作用。

一、酿酒酵母表达系统

背景与特点

酿酒酵母是一种与人类生活密切相关的微生物，自古以来用于酒类酿造和面包发酵。作为真核模式生物，酿酒酵母是目前研究最透彻的真核生物，其基因组在1996年已完成测序。这一系统最早用于表达人 α-干扰素，并成功开发出多个应用项目，包括乙肝表面抗原、粉蛋白酶和细胞因子等。

优势

1. 食品安全性高：长期用于食品工业，不产生毒素，被美国 FDA 认证为安全性生物，表达产物无需额外进行宿主安全性验证。

2. 真核表达特性：具备翻译后加工能力（如糖基化和磷酸化修饰），适合复杂蛋白表达。

3. 分泌表达能力：可以将蛋白分泌到培养基中，方便后续纯化。

4. 培养成本低：生长快速、培养条件简单，适合大规模生产。

5. 遗传操作方便：基因组小，遗传背景清晰。

不足

1. 超糖基化问题：表达的蛋白常发生超糖基化，每个 N-糖基链含有大量甘露糖，远高于哺乳动物细胞的正常水平。

2. 产量低：不易进行高密度发酵，表达产物的产量较低。

3. 遗传稳定性不足：质粒容易丢失，传代稳定性差。

4. 分泌效率有限：对于分子量大于 30 kDa 的蛋白质，分泌效率显著下降。

二、毕赤酵母表达系统

背景与发展

毕赤酵母是一种高效的外源蛋白表达系统。20世纪60年代研究发现毕赤酵母能够利用甲醇作为碳源，随后开发出了高密度培养技术，使毕赤酵母成为适合工业化生产的酵母系统。基于其强启动子（如 AOX1 启动子）的发现，毕赤酵母被广泛应用于外源基因的表达。

优势

1. 启动子强大：AOX1 启动子是目前已知最强的酵母启动子之一，能够实现高效表达。

2. 高密度培养：可进行高密度发酵，细胞干重可达 130 g/L，极大提高生产效率。

3. 灵活表达模式：既可进行胞内表达，又可实现分泌表达，方便下游处理。

4. 高产量：外源蛋白表达量可达十几克每升。

5. 遗传稳定性高：整合型表达，载体基因整合到酵母基因组中，传代稳定。

6. 适当糖基化：糖基化程度低于酿酒酵母，与哺乳动物细胞更为接近，适合医药用途。

不足

1. 酶降解问题：分泌表达的蛋白在培养过程中可能被自身分泌的蛋白酶降解。

2. 启动子依赖性：主要依赖 AOX1 和 GAP 启动子，表达调控灵活性稍逊。

3. 初始构建复杂：载体整合需要筛选多拷贝菌株，初始优化耗时较长。

三、酿酒酵母与毕赤酵母的比较

类别	酿酒酵母	毕赤酵母
安全性	广泛应用于食品工业，已被 FDA 认证为安全性生物	同样安全，适合药用，但在食品工业中应用较少
启动子强度	启动子强度较低，如 GAP 启动子	AOX1 启动子强度极高，适合高效表达
糖基化特性	易发生超糖基化，糖链含大量甘露糖	糖基化程度低，糖基化模式更接近哺乳动物
分泌能力	分泌效率低，特别是分子量较大的蛋白质	分泌效率高，但存在蛋白酶降解风险
表达量	产量低，外源蛋白占总蛋白的约 10%	产量高，外源蛋白占总蛋白的约 30%
遗传稳定性	质粒易丢失，传代不稳定	整合型表达，遗传稳定
高密度培养	不易进行高密度发酵	高密度发酵性能优异，适合工业化生产
应用领域	食品工业、模式生物研究、部分医药领域	工业酶、重组蛋白药物生产、生物燃料开发等

四、两种酵母在外源蛋白表达中的应用比较

在实验室中对人抗凝血酶基因在酿酒酵母和毕赤酵母中的表达实验表明：

• 酿酒酵母表达产物活性较低，可能与其超糖基化及翻译后修饰相关。

• 毕赤酵母表达产物活性较高，得益于其更接近哺乳动物细胞的糖基化模式及高表达量。

毕赤酵母的高密度培养技术和稳定的基因整合机制，使其在大规模生产中更具优势；而酿酒酵母则因其食品安全性和简单操作，在食品工业和模式生物研究中占据重要地位。

虽然酵母种类有1500多种，但是用于重组蛋白表达的一般有2种：毕赤酵母和酿酒酵母。毕赤酵母表达系统与酿酒酵母表达系统相比，前者表达水平更高而且可进行高密度的细胞培养。同时，酿酒酵母表达系统质粒容易丢失，传代不稳定，而毕赤酵母表达系统所有的表达载体都要整合到酵母的基因组上。另外，与Saccharomyces cerevisiae相比，Pichia在分泌蛋白的糖基化方面具有优势，因为它可能不会过度糖基化。公司提供的毕赤酵母感受态有：X33、GS115、KM71等。

X33、GS115、KM71酵母特征

酵母菌株	特征
GS115	表型：HIS4-, Mut+； 筛选含HIS4的表达载体。
X-33	表型：HIS4+, Mut+； X-33毕赤酵母被推荐用来表达含有Zeocin抗性的载体载体重组质粒，例如pPICZ A,B,C系列的载体。X33毕赤酵母含有AOX1基因，产生的转化株是Mut+基因型。
KM71	表型：MutS, Arg+；KM71转化株只能产生出His+MutS菌株。
SMD1168	表型：His4-, pep4-, Mut+；蛋白酶A缺陷型（pep4-）

说明：HIS4-，组氨酸缺陷型，在缺乏组氨酸的培养基中无法生长；如果表达载体上携带有组氨酸合成基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。

Mut+和Muts：毕赤酵母表达系统中，乙醇氧化酶有2种基因编码，即AOX1和AOX2。但是菌株利用甲醇的速度主要由AOX1编码的AOX1蛋白决定。当AOX1缺失，只存在AOX2时，细胞利用甲醇的能力低，在甲醇培养基上生长缓慢的菌株表型为Muts；相反，AOX1存在，细胞在甲醇培养基上生长较快的菌株表型为Mut+。Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率一样，存在甲醇的情况下，AOX1启动子被强烈诱导，Mut+比Muts生长的更快（4-5倍）

上述菌株都是甲醇诱导型菌株，除了X33外，其他都是组氨酸缺陷型。在以葡萄糖或者甘油等为碳源的培养基上生长时，AOX1基因的表达受到抑制。而在以甲醇为唯一碳源时，宿主菌的AOX1基因被强烈诱导，使得目的基因大量表达。

毕赤酵母适宜的生长温度是28至30度，一般可以设置在30度培养，温度超过32度对蛋白的表达是有害的，并可能导致细胞的死亡。

从研究结果来看, 蛋白胞内表达时, 可优先考虑用Muts表型, 对于分泌表达, Mut+ 和 Muts都可使用。

五、总结

酿酒酵母和毕赤酵母各有特点，适用于不同的表达需求。酿酒酵母因其食品安全性和历史悠久的应用优势，广泛用于食品工业和基础研究；而毕赤酵母凭借高表达量和适当糖基化能力，在重组蛋白生产和工业化生物技术中占据主导地位。未来，随着基因工程和合成生物学的进步，两种酵母系统将进一步优化，在更多领域发挥协同作用，为科学研究和工业生产提供更高效的解决方案。