Angew|DNA编码库：利用达尔文进化论充分发挥其潜力

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题目：DNA-Encoded Libraries: Towards Harnessing their Full Power with Darwinian Evolution

文献来源：Angew. Chem. Int. Ed. 2022, e202215542

代码：无（实验性综述）

内容：

1.背景

新型酶抑制剂，受体激动剂/拮抗剂或简单结合剂的发现是药物创新的核心，也是生物医学研究的核心。历史上，天然产物和化学合成与高通量筛选技术(HTS)相结合一直是这一过程的前沿研究。DNA编码技术的发展为这一工作流程带来了范式转变。DNA编码文库(DEL)技术极大地促进了合成分子的筛选。DNA标签使将合成分子的个体表型与到可扩增的条形码相关联。该技术可以在几天到几周内识别106-109数量级的库中最合适的配体分子。这种高速度的筛选得益于DEL的亲和力筛选过程是从文库集合中挑选最紧密的粘合剂而不是使用HTS的离散型测定。现有的生化库技术有噬菌体展示，核糖体展示以及依赖于指数富集度的配体系统进化（SELEX）。然而，DEL筛选主要使用dsDNA标签进行，dsDNA标签记录个体成员的合成路径，因此编码其结构，但不能像生化DNA编码过程（例如，噬菌体展示）那样在其合成中进行翻译。本综述涵盖了不同的DNA编码文库技术，包括生化和化学方法以及筛选方法。

2.DNA编码文库技术

DNA编码文库(DEL)是指合成分子连接到编码其结构的DNA的合成文库。

2.1生化库

由Smith在20世纪80年代开创的噬菌体展示利用具有明确定义的涂层蛋白的噬菌体，该涂层蛋白可以经过基因修饰使病毒表面能够展示融合肽序列，从而在肽库的表型与其基因型之间提供简单的连接。这两个特性的连接使得体外选择成为可能，因为可以扩增的编码区可以进行筛选。经过多轮的筛选和扩增，噬菌体展示通常可以用于10-6-10的DEL库。现在已经开发了许多噬菌体相容的环化策略来创建大型不同的单环或双环大环文库（图1。 A）。

图1 生化筛选技术。(A)环化大环细胞的噬菌体展示 (B)mRNA展示技术, RaPID(C)大环细胞的SICLOPPS筛选(D)用于功能化适配体筛选LOOPER和SELEX的组合。

核糖体显示是另一种能够将遗传信息直接翻译成肽的技术。由于mRNA显示依赖于自然界将寡核苷酸翻译成蛋白质的能力，因此它传统上仅限于天然氨基酸。2003年，Suga开发了第一个flexizyme（Fx3），一种灵活的tRNA酰化技术，能够将非天然氨基酸结合到tRNA中。遗传密码的重编程用于  Flexible in vitro Translation(FIT)，因为用flexizyme制备的非标准酰基tRNA可以用于产生含有广泛氨基酸（例如天然氨基酸，D-氨基酸，非天然侧链，·-氨基酸等）的肽。该技术已用于筛选大型化合物库以发现针对特定靶点的结合物，该过程称为随机非标准肽集成发现(RaPID)（图1.B）利用掺入非天然氨基酸的能力，通常用于制备和筛选具有比线性肽更理想药理学的大环的库。

环状肽也可以通过 Split Inteinmediated Circular Ligation of Peptides and ProteinS（SICLOPPS）来生成。包含了所需组分的向量可以对肽的可变区进行编码。该方法支持20种氨基酸以及环变化的大小，并且仅需要半胱氨酸或者天冬氨酸来进行酯交换反应以及利用天冬酰胺在细胞中释放环肽（图1.C）。

mRNA显示，噬菌体显示和SICLOPPS库等大型库可以进行多轮选择来筛选大环，以滤除假阳性并富集所选结合物。SELEX通过这种方式可以提供了寡核苷酸（结合物）。寡核苷酸库的优点是基因型和表型同时表示，不需要“翻译”步骤。核酸可以使用简单的工作流程自行进行分子进化：从寡核苷酸库开始，选择所需的性质，制作更多带有一些错误的副本以引入随机变化和重复周期。然而，SELEX只支持4个核碱基。Hili等人开发了 Ligase-catalyzed OligO nucleotide  PolymERisation (LOOPER)技术，其将SELEX与修饰核苷酸结合以产生高功能化核酸聚合物（HFNAPs）（图1. D)该工作使用3个字母密码子来编码修饰，从而实现更广泛的多样性。

所有这些生化文库合成都利用方法将DNA或RNA“翻译”成感兴趣的分子。它依赖于重复选择/放大周期。此外，易错PCR可用于重新引入多样性。这在SELEX实验中经常发生，因此在其最简单的表现形式中真正记录了达尔文进化的全部力量。然而，上述技术的一个限制是它们提供的特定生物聚合物不具有药物样小分子的所有理想药理学特征。不断增长的生化库显着增加了可探索的化学空间的边界，但是对化学多样性空间的其他领域：如已知在药物化学中非常重要的杂环和多环框架，仍然是非常困难的。

2.2化学库

化学库可以根据药物性质设计具有更广泛的功能分子，同时不会受到像生化库中的酶催化范围的限制。化学DEL主要有5种技术。1.DNA-模板合成(DTS)2.PNA编码合成（杂交到互补DNA用于解码）3.定向筛选：通过给定的分裂和混合合成路径路由含有特定密码子的DNA4,自组装文库，其中多样性来自DNA标记片段的组合配对（超分子方法）5.引物延伸或酶联dsDNA标签编码分裂和混合合成。从技术上讲，后一种方法（酶标）是最容易获得的，并且也是几种商业服务商（HitGen，X-Chem）和商业图书馆中最常用的方法。这些方法中的每一种的范围都经过了广泛的审查。在这里，我们将重点关注能够将DNA代码“翻译”到合成分子中的技术。这些技术能从第一轮选择中放大选定的库成员，基本上重现达尔文进化的两个重要步骤：选择和放大。

图2 化学筛选技术(a)大环的DTS(B)Yoctoreactor通过滚动翻译再生文库物种(C)通用模板合成(D)无酶聚合物翻译(E)定向筛选。

DTS在2001第一次被提出，用于进行与DNS无关的产物合成。该方法通过杂交使活性组分相连接并且令合成分子连接上DNA。DTS支持迭代循环筛选因此可以对那些选中的结合物进行富集操作。图2.A展示了一个大环库的大致流程。在两个筛选周期后，获得了碳酸酐酶结合剂的富集，重现了合成产物进化的两大重要步骤：选择和放大。DTS的合成产物往往需要单条的DNA链，而这会在筛选阶段中导致潜在的问题：包括库盛源直街非特异性的杂交以及ssDNA链的折叠。“Yoctoreactor”(yR)在概念上是相关的，因为合成是以模板方式实现的，但使用三向连接协调反应伙伴之间的距离。该术语来自DNA三连接中心的估计体积（10-24升）。该技术涉及三个DNA链（组合组装），其折叠以使反应性官能团接近，同时使编码区域远离反应位点（图2. B）。在筛选之前，通过拆卸Yoctoreactor来暴露合成化合物。然后可以使用“滚动平移”放大和重新整合化学水分，从而实现多个选择周期。该技术还具有额外的优点，即它不需要每个化合物都具有一个DNA链，但是其翻译需要更多步骤。另一个基于DTS的DEL依赖于通用模板，从而减少了复杂的模板准备。它利用脱氧肌苷的混杂，可以与所有4个核碱基杂交。该方法利用多重杂交，反应，光裂解周期产生不同的文库。图2. C显示在一个选择周期后94.7倍富集已知的碳酸酐酶II蛋白结合物。

DTS是化学等价的生物过程，能够将DNA（基因型）翻译成具有特定性质（表型）的合成分子。而基于模板定向合成XNa的非酶方法可以产生更多的种类的分子。David Liu的实验室开发了肽核酸（PNAs）的翻译，选择，扩增系统。该方法进一步发展为用PNA编码合成低聚物，其将经历序列依赖性连接，然后切割PNA以释放由DNA模板编码的合成聚合物（可以进行扩增来重复周期）(图2. D)。在开发DTS的同时，Harbury实验室开发了用于制备DEL的DNA定向分选。在该方法中，通过杂交到对应于给定合成转化的反密码子的固定化序列，将ssDNA序列文库分裂成不同的池（图2. E）。在每一步之后，这些库被池化，并且可以执行进一步的合成循环。因此，通过这种DNA筛选，分子的表型编码在其合成路径中。

2.3自组装库

图3 自组装库。具有静态（A-C）或动态特性（D-F）的不同格式的自组装及其在重复选择/放大（G-H）中的应用。

自组装的DEL库是通过杂交而不是共价连接器组装片段而形成的。杂交可以是热力学稳定的，静态的片段对，或者动态地交换片段组合。这种超分子方法的一个特点是大库可以通过配对较小且特性更好的库来获得。片段配对的第一个例子由Neri和同事报道，并通过将其与各种片段库配对来关注药物亲和力的程度(图3. A)。在第一个示例中，库大小没有通过配对放大，但技术迅速发展到能够提供组合输出的片段库。通过Klenow的填充反应可以编码双输出的结果(图3. B)。这些方法在非动力学的库中用的很多。也有相似的技术可以用于动态的DEL来分辨不同片段的关系。在这些库中，靶点蛋白会干煸自己的构象以获得最佳的结合剂。此时，我们需要一个冻结步骤获得做好的结合姿势。这些动态结合库可以扩增那些结合最紧密的化合物。一般来说，这些分子占100*100库中的0.01%，打死你会靶点蛋白的加入可以将这个数值提高到1%。

张等人开发了一种Y形DNA组装体，仅当存在靶点蛋白存在时才能产生编码两个片段的ssDNA(图3. D)该方法将组合输出与额外的富集步骤相结合。还使用亚胺还原来阻止胺DEL文库和醛锚点之间的可逆反应，以便扫描片段亲和力（图3.E）。图3. C展示了不同的自组装的结构。通过杂交到模板（图3.C，线性体系结构）来组装库提供了在选择之后放大组装指令的独特机会，以便用从第一轮选择中出现的片段重新组装库（图3.G。）通过对碳酸酐酶和凝集素的选择证明了这种方法。在这种情况下，合成分子用PNA编码，其与标准固相肽合成(SPPS)相容并且促进传统的分裂和混合方法。该架构使用对两个PNA片段的DNA模板，这些片段可以在使用最合适的配对组合的信息进行选择后扩增。通过将扩增的DNA瞬时固定在链霉亲和素树脂上并用过量的PNA缀合物处理以捕获所需的合成产物来促进文库的重新组装。前面提到的化学和自组装技术能够实现大型文库制备，高效筛选和解码分子以及迭代筛选周期以丰富最佳结合剂，但它们都无法实现分子多样性的产生，而是达尔文进化的关键步骤。

进化的一个重要组成部分是血统交叉（有性生殖）或DNA交叉，促进了相对于随机诱变的联合突变的出现。在分子水平上，这可以通过DNA shuffling来实现（图4. A）。为了真正理解重组的真正力量，基于传统DEL的Satz描述的模拟的数学建模，用于解释在每个选择周期之后的shuffling因素。为了举例说明优点，我们在四个不同位置（42=16化合物）使用由2个构建块（蓝色和红色）组成的自组装DEL再现了建模（图4. B）。如图4. B 所示，在重组的情况下，最合适的结合剂的收敛速度比在没有重组的情况下更快。前2500个粘合剂的选择排名与亲和力排名的图表清楚地显示了包括重组在内的选择与不重组的差异（图4. C）。

3.筛选方法

传统上，亲和力选择用于筛选DEL的最佳活方法。虽然这种方法是高效的，快速的，并且适合于一系列的蛋白质，表明功能分析发展的需要，但命中的可比性可能会被人工设置的亲和力选择所抵消。首先，击中可能不会与目标上的生物相关活性位点相互作用，限制其生物活性（除非用于PROTAC开发）。其次，将靶点蛋白固定在固体支架上并不代表蛋白质的原生环境，在更复杂的试验中测试时，原生环境可能导致低命中。开发新颖和更精细的筛选技术将使筛选更复杂的蛋白成为可能，提高命中质量，并有可能用于在筛选步骤中直接进行达尔文进化。图5分别展示了化学库和生化库所采用的不同筛选方法。

图5 化学DEL（A-H）的筛选方法

图6 生化DEL的筛选方法

4.结论

将带有DNA标签的离散合成有机分子编码为可放大条形码，可以用较少的资源以前所未有的速度进行前所未有的大小筛选。值得注意的是，许多困扰组合化学早期的问题（库成员的溶解度，生化测定中导致假阳性的杂质，异质反应产率）在DEL中被证明是不那么严重的问题，因为DNA标签提供均匀溶解度和亲和力筛选比基于活性的测定或基于细胞的测定更不是人工制品。截断反应产物往往比最终产物具有较低的亲和力，即使作为一个馏分存在，在理想的情况下，DNA扩增的力量也可以补偿最终产物的低丰度。在化学多样性和这类生物化学编码文库的筛选方面也取得了巨大的进展。在化学多样性前沿，具有更理想的药理学的大环或多环肽以及包络的寡核苷酸是可以获得的。虽然达尔文进化的概念很简单（选择理想的性质，在引入一些变化的同时产生更多的选择分子，reiterate），其对小分子进化的实际实施需要将DNA翻译成合成分子的技术。这个翻译步骤添加了一些其他DEL（选择/解码）没有的约束。但是这对于大多数药物发现工作来说可能已经足够了。

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