文献介绍
文献题目： Highly efficient and robust π-FISH rainbow for multiplexed in situ detection of diverse biomolecules
研究团队： 曹罡（华中农业大学）、戴金霞（华中农业大学）
发表时间： 2023-01-27
发表期刊： Nature Communications
影响因子： 16.6
DOI： 10.1038/s41467-023-36137-4
摘要
在生物学前所未有的单细胞测序和空间多组学时代，非常需要具有更高灵敏度和稳健性的荧光原位杂交（FISH）技术，特别是用于检测短 RNAs 和其他生物分子。在这里，我们开发了强大的多重 π-FISH rainbow 方法来单独或同时高效地检测不同的生物分子（DNA、RNA、蛋白质和神经递质）。这种多功能方法已成功应用于检测从微生物到植物和动物的不同物种的基因表达。此外，我们仅通过两轮杂交就解码了 21 个标记基因的空间分布，从而描绘了不同神经元亚群的景观。值得注意的是，我们将 π-FISH rainbow 与杂交链式反应相结合，开发了针对短核酸片段的 π-FISH+ 技术，例如患者循环肿瘤细胞中的 microRNA 和前列腺癌抗雄激素治疗耐药标记物 ARV7 剪接变体。我们的研究为空间多组学研究和临床诊断提供了强大的生物分子原位检测技术。
前言
细胞功能多样性源于复杂且组织良好的生物系统中的细胞异质性和各种微环境。确定组织环境中的细胞类型和分子特性对于破译单个细胞的独特功能尤其必不可少。大规模单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 的出现极大地促进了多细胞生物中细胞异质性的识别。然而，它缺乏每个细胞类群的空间位置和周围组织微环境信息。FISH 技术可以通过特异性杂交解析核酸的空间位置，这为在单细胞或单分子水平上精确定位细胞亚型和空间分布关系提供了前所未有的见解。FISH 广泛用于研究许多物种的基因表达和染色体拷贝数变异，因为抗体的可用性和特异性远远落后于当前生物研究爆炸性增长的需求，特别是非编码 RNAs 和剪接变体的检测。因此，新一代生物学研究和临床诊断迫切需要具有更高灵敏度、特异性、空间分辨率和稳健性的新一代尖端 FISH 技术。
最近，已开发出多种方法来提高 FISH 信号强度，例如杂交链式反应 (HCR)、交换反应信号放大 (SABER)、分支链 DNA (bDNA) 放大、AmpFISH、基于杂交的滚环扩增（RCA）。HCR 是一种核酸聚合反应，可引发发夹寡核苷酸自折叠的级联反应。在最新版本的 HCR（version 3.0）中，split 探针可以有效抑制背景信号。SABRE 通过在体外合成偶联杂交支架来放大荧光信号。bDNA 扩增方法显着增加了荧光信号的强度，而无需增加荧光点大小。RCA 是一种恒温核酸扩增技术，也可以产生强信号。AmpFISH 探针通过 RCA 在体外制备，用于放大检测信号。高通量 FISH 方法，包括 MERFISH、SeqFISH+ 和 split-FISH，利用组合标记和顺序成像来可视化单个细胞中数百至数千个基因的表达。这些方法克服了检测单细胞中 RNA 种类数量的限制，并且可以阐明原位基因表达谱的综合情况。
尽管 FISH 方法取得了巨大进步，但新一代 FISH 技术仍处于起步阶段，存在各种尚未解决的挑战需要进一步克服。(i) 它们需要大约 500 bp 或更长的核酸序列来进行多重目标探针杂交，限制了短 RNAs（例如 microRNA）、特定剪接变体和狭窄基因组位点的检测。(ii) 使用 MERFISH 和 seqFISH+ 方法的几项优秀工作共同检测了同一样本中的 DNA、RNA 和蛋白质。这些方法对三种分子的联合检测是通过单独的杂交、成像和随后的集成信号分析来实现的，这更加耗时且更具挑战性，特别是对于 3D 图像的对齐。因此，迫切需要一种更高效、更准确的 DNA、RNA 和蛋白质的一步同时三重检测方法。(iii) 在保持低背景噪声的同时实现高信号强度和效率仍然具有挑战性。例如，尽管 RCA 可以增加检测信号的强度，但在复杂的生物组织中实现高酶促反应效率仍然具有挑战性。对于没有放大的方法，需要增强成像灵敏度以可视化微弱信号，但同时也增加了背景噪声。
为了解决当前 FISH 技术的挑战，我们开发了一种高效的多重 π-FISH rainbow 方法，具有高强度信号和低背景噪声。这种稳健的方法已应用于冷冻、石蜡和整体样本中的动物、植物和病原微生物。此外，π-FISH rainbow 可以在单分子水平上同时检测 DNA、RNA、蛋白质。值得注意的是，我们进一步将 π-FISH rainbow 与 HCR 结合开发了 π-FISH+ 技术，以克服短序列检测的限制。该技术可以识别循环肿瘤细胞 (CTCs) 中的雄激素受体剪接变体 7 (ARV7)，以诊断前列腺癌的治疗耐药性，并可视化 microRNA 和非编码 RNA。
研究结果
1. π-FISH rainbow 的设计和验证
为了提高 FISH 效率、稳定性、灵敏度和特异性，我们开发了 π-FISH rainbow 方法，其中主要 π-FISH target 探针在中间区域包含 2-4 个互补碱基对（步骤 i）（Fig. 1a）。这种设计有利于 split 探针形成 π 型键，以增加杂交和洗涤过程中的稳定性，最终提高效率和特异性。接下来，利用二级 U 形（步骤 ii）和三级（步骤 iii）U 形放大探针来放大信号。最后，使用荧光信号探针来可视化信号（步骤 iv）。π-FISH rainbow 工作流程和探针序列的详细信息分别显示在 Supplementary Fig. 1 和 Supplementary Data 1 中。值得注意的是，通过组合不同的荧光信号探针（π-FISH rainbow），我们可以在一轮中实现多重目标检测。
a. π-FISH rainbow 过程示意图。
b-c. 通过检测 HeLa 细胞中的 ACTB mRNA，比较 π 靶向探针（具有 2 个互补碱基对）与传统 split 探针的杂交效率（b）。Scale bars, 10 μm。对 Spots/cell 进行计数并显示为直方图 (c)。n = 90 cells per group。
d. 通过检测 HeLa 细胞中的 PPIA mRNA 来测量 0、2、4、6、8 个互补碱基对对信号和噪声的影响。n = 50 cells per group。
e-g. 通过检测 HeLa 细胞中的 ACTB mRNA 比较 π-FISH Rainbow、HCR、smFISH、smFISH-FL 之间的杂交效率 (e)。计算并说明每个细胞的 spot 计数（f）和每个 spot 的荧光强度（g）。Scale bars, 10 μm。 f π-FISH rainbow, n = 47 cells; HCR, n = 53 cells; smFISH-FL, n = 33 cells; smFISH, n = 40 cells。数据表示为 mean ± s.e.m。使用 Two-tailed unpaired Student's t test。**P < 0.01; ****P < 0.0001; ns, not significant。smFISH-FL vs. smFISH, P = 0.8616; HCR vs. smFISH-FL, P = 1.26 × 10−5; π-FISH rainbow vs. HCR, P = 0.0081; π-FISH rainbow vs. smFISH-FL, P = 1.04 × 10−9。g π-FISH rainbow, n = 8362 spots; HCR, n = 9564 spots; smFISH-FL, n = 14234 spots; smFISH, n = 14241 spots。箱线图中线 = 中位数，箱限 = Q1 (25th percentile)/Q3 (75th percentile)，whiskers = minimum and maximum values，points = outliers (>1.5 interquartile range)。
h. 通过 π-FISH rainbow 检测到 MALAT1 在 HeLa 细胞中的三种亚细胞定位模式。Scale bars, 10 μm。
i-n. 检测 ASFV B646L mRNA (i)、结核分枝杆菌 16S rRNA (j)、弓形虫 SAG1 mRNA (k)、玉米穗 KN1 mRNA (l)。斑马鱼胚胎中 deltaA（绿色）和 ntla（红色）的共同检测 (m) 。通过 π-FISH rainbow 联合检测小鼠小脑中的 Pvalb（绿色）、Calb1（红色）和 Nrgn（洋红色）(n) 。Scale bars, 10 μm (i), 2.5 μm (j), 5 μm (k), 50 μm (l), 200 μm (m), and 50 μm (n)。
o. 通过 π-FISH rainbow 联合检测小鼠脑中的 olig2 和 Gad1 mRNA，并带有血管标记。Scale bar, 50 μm。
首先，我们比较了 π target 探针（具有互补碱基对）与传统 split 探针（不具有互补碱基对）的杂交效率。我们的数据表明，当使用一对或五对 π target 探针时，π target 探针检测到的信号点比传统 split 探针更多（Fig. 1b, c and Supplementary Fig. 2a, b），这表明 π target 探针设计可提高杂交效率。我们发现 2-4 个互补碱基对几乎实现了最高的杂交效率，同时保持了较低的背景噪声（Fig. 1d and Supplementary Fig. 2c, d）。接下来，我们优化了每个基因的 π target 探针数量，并观察到 10-15 个探针产生了峰值信号点（Supplementary Fig. 2e, f）。虽然具有更多 target 探针的荧光点具有明显更高的信号强度，但不同数量的 target 探针的 spots 宽度具有可比性（Supplementary Fig. 2g, h）。对于扩增探针，使用我们的 U 形双边扩增探针杂交产生的信号强度高于传统 L 形单边扩增探针产生的信号强度（Supplementary Fig. 2i）。同时，验证了 π-FISH rainbow 的 π target 探针和扩增探针（二级和三级探针）的特异性，对照（单侧靶探针、无靶探针、无扩增探针）中没有特异性荧光点（Supplementary Fig. 2j）。
此外，我们测试了 π-FISH rainbow 的多重目标检测效率。理论上，四个荧光信号探针的组合可以产生 15 (C14 + C24 + C34 + C44) 种不同的信号编码，并在一轮中区分 15 个基因（Supplementary Fig. 3a）。为了在合并荧光信号编码期间为每个荧光通道信号生成一致的亮度，每个 mRNA π target 探针的数量根据荧光颜色的数量而增加。我们的数据表明，HeLa 细胞原位检测过程中两个和三个荧光信号的重叠率分别为 99.14% 和 99.06%（Supplementary Fig. 3b, c），表明 π-FISH rainbow 用于多重检测和解码的高效性和准确性。多通道解码对 Gad1 和 Vip 基因的检测效率分别为单通道检测的 99.03% 和 99.10%（Supplementary Fig. 3d–h）。因此，不同信号探针的组合用于 π-FISH rainbow 的多重目标检测是高度可靠的。
为了彻底评估 π-FISH rainbow 的噪声水平，我们使用不同的对照对 HeLa 细胞中的 ACTB、PPIA、B2M 基因进行了原位检测，并对小鼠脑组织中的 Ctgf、Penk、Sst 基因进行了原位检测，包括单边 target 探针，无 target 探针、RNase 处理、细菌 dapB 探针（Supplementary Fig. 4a–d）。我们的数据显示阴性对照组中的信号点可以忽略不计（Supplementary Fig. 4e–h）。为了验证 π-FISH rainbow 单次或多重检测的假阳性率，我们引入了脱靶探针、细菌 dapB 探针和单侧特异性探针作为额外的阴性对照。π-FISH rainbow 的假阳性率低于 0.51%（Supplementary Fig. 5）。
为了进一步分析 π-FISH rainbow 的效率，我们将 π-FISH rainbow 与 HCR、smFISH、smFISH-FL（FL，full-length transcripts）进行了比较。除 smFISH-FL（整个转录本都被探针覆盖）外，所有技术均使用类似数量和大小的针对 HeLa 细胞中 ACTB mRNA 的探针（Fig. 1e）。比较通过这些方法检测到的每个细胞的 ACTB 信号点计数表明 π-FISH rainbow 具有最高的灵敏度（Fig. 1f）。π-FISH rainbow 产生的荧光信号强度也显着高于其他方法产生的荧光信号强度（Fig. 1g and Supplementary Fig. 6a-d）。同样，我们使用 π-FISH rainbow、HCR 和 smFISH 测试了其他中等丰度（PPIA 和 B2M 基因）和低丰度（MTOR 基因）转录本，最终验证了 π-FISH rainbow 明显更有效（Supplementary Fig. 6e）。
为了验证 π-FISH rainbow 的特异性，我们检测了小鼠脑组织中的高表达基因（Cux2 和 Pcp4）和低表达基因（Lrmp 和 Ptpru），并重现了 Allen 脑科学研究所描述的空间分布（Supplementary Fig. 7a–d)。π-FISH rainbow 在小鼠大脑皮层中揭示的 Sst 和 Vip 以及 Gad1 和 Slc17a7 相互排斥的基因表达模式进一步支持了我们方法的特异性（Supplementary Fig. 7e–h）。接下来，我们通过检测 HeLa 细胞中长链非编码 RNA (lncRNA) MALAT1 的亚细胞定位模式来测试 π-FISH rainbow 特异性。先前的研究报告了该 lncRNA 的两种定位模式：大部分 MALAT1 通常位于细胞核中，但在 G2/M 期期间在细胞质中观察到主要信号。我们的 π-FISH 分析明确证明了不同细胞中 lncRNA MALAT1 的核模式和细胞质模式（Fig. 1h）。由于 π-FISH rainbow 的高效性和特异性，我们首次揭示了 lncRNA MALAT1 的第三种定位模式：细胞质和细胞核中均存在低水平的转录本（9.1% of cells; Fig. 1h and Supplementary Fig. 7i, j)。
为了进一步证明 π-FISH rainbow 在不同物种中的稳健性，我们首先将其应用于微生物（包括细菌、病毒和寄生虫）的基因检测。如 Fig. 1i 所示，我们成功检测到猪肺泡巨噬细胞中非洲猪瘟病毒（ASFV）B646L 基因的表达。由于许多细菌，特别是结核分枝杆菌细胞壁厚且脂质含量高，因此很少有有效的 FISH 方法来检测这些细菌中的基因表达。在这里，我们使用 π-FISH rainbow 明确鉴定了结核分枝杆菌的 16S rRNA（Fig. 1j）。我们还在寄生泡中检测到了弓形虫的速殖子标记基因 SAG1（Fig. 1k）。此外，π-FISH rainbow 应用于植物中检测石蜡包埋的玉米穗中 KN1 基因的表达（Fig. 1l）。接下来，我们利用 π-FISH rainbow 检测斑马鱼整体胚胎中的 deltaA 和 ntla mRNA（Fig. 1m）。最后，我们检测了 Calb1、Nrgn、Pvalb mRNA，以区分冰冻切片中小鼠小脑皮质的分子层、浦肯野细胞层和颗粒细胞层（Fig. 1n）。我们的结果证明了 π-FISH rainbow 的多功能性，可应用于冷冻、石蜡和整体样本中的多种物种。
最后，我们测试了 π-FISH rainbow 与其他成像技术（例如血管标记）的兼容性。为此，采用生物素化番茄凝集素来观察小鼠大脑中的血管。随后，利用 π-FISH rainbow 进行原位基因检测。通过这种策略，我们可以评估血管、olig2（少突胶质细胞标记基因）、Gad1（抑制性神经元标记基因）的空间分布（Fig. 1o），这表明 π-FISH rainbow 与其他成像生物技术高度兼容。
2. π-FISH rainbow 在空间细胞类型配准中的应用
单细胞测序通过识别特定细胞亚型的各种标记基因，彻底改变了组织中细胞组成的探索。在这里，我们利用 π-FISH rainbow 通过解析标记基因的单细胞图谱来进一步确定完整组织中细胞的空间景观（Fig. 2a）。首先，通过组合四种荧光信号探针，使用 π-FISH rainbow 同时测定小鼠初级体感皮层（S1）中九个皮质层特异性兴奋性神经元标记基因的空间分布（Fig. 2b）。我们使用 Imaris 软件通过通道算法、细胞分割和点识别来解码单个基因的表达模式（Fig. 2c and Supplementary Fig. 8）。如 Supplementary Fig. 9a 所示，层特异性标记基因显示出层梯度分布，在主表达层中存在峰值波。为了进一步定义皮质亚层，我们根据基因表达峰渲染细胞，准确地再现传统的特定层空间模式并精确地区分 L5a 和 L6b 亚层（Fig. 2d）。
a. 通过两轮 π-FISH rainbow 杂交和成像对小鼠 S1 中锥体神经元和中间神经元亚类进行空间解码的图。第一轮检测到 9 个兴奋性神经元标记基因，随后进行信号清除和 12 个中间神经元标记基因的第二轮杂交。通过结合两轮信号，获得了 S1 中 13 个中间神经元亚类的空间映射。
b. π-FISH rainbow 同时检测到 S1 中 9 个层特异性兴奋性神经元标记基因（Rasgrf2、Cux2、Plcxd2、Rorb、Kcnk2、Sulf2、Foxp2、Pcp4、Ctgf）。白色虚线表示皮质的边界。Scale bar, 100 μm。
c. 对 (b) 中的信号进行解码和映射，显示了 S1 皮质 L1-L6 层中 9 个神经元标记的空间分布。S1 中皮质的 L1 和 L6 由黑色虚线表示。
d. π-FISH rainbow 准确地再现了层特异性标记基因的空间分布，特别是在 L5a 和 L6b 亚层中。 Scale bar, 100 μm。
e. 12 个中间神经元标记基因（Gad1、Sst、Crh、Npy、Cck、Vip、Pvalb、Gda、Penk、Cxcl14、Cpne5 和 Lphn2）的第二轮杂交，在同一切片（上）。(i-viii) 较高放大倍数的图像显示在底部。S1 的边界用白色虚线标记。 Scale bars, 100 μm (top) and 5 μm (bottom)。
f. 基于两轮杂交的 13 个 Gad1+ 中间神经元亚群在不同层中的分布。Scale bar, 100 μm。
g. S1 中 13 个 Gad1+ 中间神经元亚类的层分布气泡图。Int 9 和 Int 10 亚类主要分布在浅层（L2/L3），而 Int 6 亚类主要分布在深层（L5 to L6）（浅红框）。中间神经元亚类的数量由点的大小表示。n = 427 Gad1+ 中间神经元。(f) 和 (g) 中的 Int1 至 Int16 对应于由 Zeisel et al. 发表的 scRNA-seq 定义的中间神经元亚类。
先前的 scRNA-seq 分析已将小鼠 S1 中的 Gad1+ 中间神经元分为多个亚类。我们利用 S1 中 scRNA-seq 数据中的 12 个中间神经元标记基因来测试 π-FISH rainbow 在细胞亚群空间配准中的能力。首先，我们洗掉了 9 个层特异性标记基因的第一轮杂交信号，并对同一组织切片中的 12 个中间神经元标记基因进行了第二轮杂交（Fig. 2e）。根据中间神经元标记基因的表达模式，我们解析了 S1 中 13 个 Gad1+ 中间神经元亚类的空间结构（Fig. 2f and Supplementary Fig. 9b）。正如预期的那样，兴奋性和抑制性神经元标记基因标记了不同的细胞（Supplementary Fig. 9c）。基于第一轮层特异性标记基因杂交信息，我们进一步计算了 13 个 Gad1+ 中间神经元亚类在皮质亚层中的分布。如 Fig. 2g 所示，Int 9 和 Int 10 亚类主要分布在浅层（L2/L3），而 Int 6 亚类主要分布在深层（L5 to L6）。总之，这些结果表明 π-FISH Rainbow 可广泛应用于 scRNA-seq 后的空间细胞类型配准。
3. 使用 π-FISH rainbow 多重原位检测蛋白质和神经递质
通过免疫荧光对蛋白质进行常规原位检测的通量受到二抗种类数量的限制。此外，为了检测低表达蛋白，通常需要酶扩增，例如 TSA 系统，但会增加背景噪声并降低空间分辨率。为了提高蛋白质原位检测的通量和灵敏度，我们将抗体与不同的单链 DNA (ssDNA) 偶联，然后使用 π-FISH rainbow 来检测目标 ssDNA。该策略包括两个步骤：(i) 将具有特定条形码的 ssDNA 与不同的抗体偶联，并将 ssDNA 偶联的抗体与靶蛋白一起孵育。(ii) 延伸探针与 ssDNA 杂交，然后使用 π-FISH rainbow 进行信号放大（Fig. 3a）。
a. 通过 π-FISH rainbow 原位检测多种蛋白质和神经递质的示意图。(i) 将抗体与带条形码的 ssDNA 偶联，然后与靶蛋白和神经递质一起孵育。(ii) 探针与带条形码的 ssDNA 杂交，并使用 π-FISH rainbow 进行信号放大。
b. 分别通过 π-FISH rainbow 和常规免疫染色检测转染 rAAV-E2 质粒的 HeLa 细胞中的 CSFV E2 蛋白。Scale bar, 10 μm。
c. (b) 的强度曲面图分析。缺乏 E2 蛋白和背景的细胞分别用椭圆形区域和三角形区域表示。
d. 分别使用不同稀释度的一抗（1:100、1:1000、1:5000 和 1:10,000）通过常规免疫染色（上）和 π-FISH rainbow（下）检测 pol II 蛋白。Scale bars, 10 μm。
e. (d) 的每个细胞的平均信号强度的量化。n = 20 cells per group。数据表示为 mean ± s.e.m。两组比较采用 Two-tailed unpaired t test (1:100, P = 0.0137; 1:1000, P = 1.64E-29; 1:5000, P = 9.82E-38; 1: 10,000, P = 1.89E−39)。*P < 0.05；****P < 0.0001。
f. 通过 π-FISH rainbow 同时检测 CSFV 和 PCV2 共感染 PK-15 细胞中的 CSFV E2、PCV2 Cap、IFNG-flag 和 pol II 蛋白。Scale bars, 10 μm。
g. 通过 π-FISH rainbow 联合检测小鼠大脑皮层中的 GABA 和 NeuN。黄色箭头表示共表达 GABA 和 NeuN 的细胞，白色箭头表示仅表达 NeuN 的细胞。皮质的边界由白色虚线表示。Scale bars, 150 μm。
为了评估该策略的特异性、灵敏性和背景噪声，我们在 HeLa 细胞中表达猪瘟病毒 (CSFV) E2 蛋白，并将传统免疫荧光（使用二抗）与 π-FISH rainbow 策略进行比较（Fig. 3b）。π-FISH rainbow 和传统免疫荧光方法在 E2 蛋白表达细胞中显示出相似的染色模式和信号变化趋势（Supplementary Fig. 10a, b）。值得注意的是，强度表面图的分析表明，π-FISH rainbow 产生了更高强度的荧光信号和更少的背景噪音（如椭圆形区域中缺乏 E2 蛋白的细胞和三角形区域中没有细胞的区域所示）（Fig. 3c and Supplementary Fig. 10a–c)。我们进一步通过一抗系列稀释测试了 π-FISH rainbow 在蛋白质检测中的灵敏度。我们的数据表明，稀释 10,000 倍后，π-FISH rainbow 仍然可以检测到 RNA 聚合酶 II (pol II) 的强信号，而传统免疫荧光的信号几乎不可见（Fig. 3d, e and Supplementary Fig. 10d–g ）。重要的是，阴性对照中的噪声信号可以忽略不计（Supplementary Fig. 11a–h）。此外，通过在 HeLa 细胞中共同检测 Pol II（内源蛋白）和 CSFV E2（外源蛋白）来评估 π-FISH rainbow 的假阳性率为 0.25%（Supplementary Fig. 11i）。这些数据共同验证了 π-FISH 策略在蛋白质检测中的高灵敏度和特异性。
为了进一步测试 π-FISH rainbow 在多重蛋白质检测中的能力，我们将 IFNG (interferon-gamma)-flag 转染到 PK15 细胞中，并用 CSFV 和猪圆环病毒2（PCV2）感染细胞。π-FISH rainbow 同时检测 CSFV E2、PCV2 Cap、IFNG-flag 和 pol II 蛋白，并清楚地描绘出这四种蛋白在单个细胞中的表达模式（Fig. 3f）。由于许多小分子具有半抗原特性，可以被抗体特异性识别，例如 γ-氨基丁酸（GABA），一种抑制性神经递质，因此我们采用 π-FISH rainbow 与 ssDNA 偶联的抗体同时检测 GABA 和 NeuN。Fig. 3g 显示，π-FISH rainbow 清楚地检测到 GABA 在小鼠大脑皮层中的分布，特别是在 NeuN 阳性细胞中。总体而言，由于其高灵敏度、特异性和高通量能力，π-FISH rainbow 可广泛用于破译不同组织和器官中多重蛋白质和小生物分子的空间景观。
4. 通过 π-FISH rainbow 同时原位检测 DNA、RNA 和蛋白质
为了测试 π-FISH rainbow 在 DNA 检测中的应用，我们首先设计了一对 π 目标探针来检测端粒中的重复基因组区域，另一对用于检测 HeLa 细胞中 2 号染色体上的着丝粒。两种目标探针在端粒和着丝粒区域都产生了清晰的信号（Supplementary Fig. 12a）。该策略还可以识别 HeLa 细胞中的多倍体（Supplementary Fig. 12b,c）。我们进一步靶向 BHK 细胞中的非重复基因组位点（Actb 基因组位点），发现使用 35 π target 探针可以获得特定信号（Supplementary Fig. 12d）。接下来，采用该策略来验证染色体易位。为此，我们重新分析了 THP-1 细胞的 DLO Hi-C 数据，并确定了 9 号和 11 号染色体之间的假定易位（Fig. 4a）。为了确认易位，我们设计了针对 9 号和 11 号染色体上相应位点的 π-FISH 探针。我们的数据明确地在 THP-1 细胞中识别出这种易位，但在作为对照的 HEK293T 细胞中未识别出这种易位（Fig. 4b, c）。
a. 根据 DLO Hi-C 数据，THP-1 细胞中 9 号染色体和 11 号染色体之间的假定易位位点。
b-c. 通过 π-FISH rainbow 检测 THP-1 细胞 (d) 和对照 HEK293T 细胞 (e) 中染色体 9（绿色）和 11（红色）中的易位位点，证实了 THP-1 细胞中的易位。Scale bars, 2.5 μm。
d. 基于来自三个荧光通道的单个和合并信号的 π-FISH rainbow 检测 22 号染色体长臂上的 7 个位点的示意图：Ch 1, channel 1; Ch 2, channel 2; Ch 3, channel 3。
e. 在 3D 图像中解码并重建 22 号染色体长臂上的七个位点（矩形框 i 和 ii）的杂交信号。Scale bar, 3 μm。
f. 基于杂交信号的 22 号染色体长臂的同源染色体结构。
g. 通过共焦 Z 轴扫描同时检测 HeLa 细胞中的 lncRNA NEAT1 及其靶标 MAPK15 基因组位点。NEAT1 和 MAPK15 信号探针分别用 Alexa Fluor 647（洋红色）和 Alexa Fluor 488（绿色）标记。Scale bar, 2.5 μm。
h. 使用 π-FISH rainbow 在 HeLa 细胞中同时检测 Pol II 蛋白（红色）、NEAT1 mRNA（洋红色）及其靶基因组位点（MAPK15，绿色），然后进行共聚焦 Z 轴扫描。Scale bar, 2.5 μm。
基因组的 3D 结构调节许多重要的细胞功能，包括 DNA 复制和转录。为了直接可视化基因组的 3D 结构，我们应用 π-FISH rainbow 进行多重基因组位点检测。首先，将一个基因组靶标的两个荧光信号探针组合起来，测试多重信号编码的可行性。我们的数据显示，针对一个基因座的两个荧光信号重叠（Supplementary Fig. 12e, f），表明该方法在多重基因组基因座解码中的可靠性。然后，我们使用组合信号探针同时靶向 22 号染色体长臂上的 7 个位点（Fig. 4d）。这七个位点的 3D 空间分布如 Fig. 4e 所示。接下来，我们解码了杂交信号并描绘了 22 号染色体长臂的粗略染色质结构。值得注意的是，我们观察到同源染色体之间存在显着的 3D 结构差异（Fig. 4f）。
DNA、RNA 和蛋白质通常形成动态复合物来实现其生理功能。迫切需要一种简单而有效的方法来同时可视化这些复合物的时空组织。因此，我们开发了 π-FISH rainbow 来实现不同类别生物分子（DNA、RNA、蛋白质）的同时联合检测。研究表明，丝裂原激活蛋白激酶 15 (MAPK15) 可能是 lncRNA 核富集丰富转录物 1 (NEAT1) 的反式结合位点。为了直接确认 MAPK15 和 NEAT1 之间的相互作用，我们设计了针对 MAPK15 基因组位点和 NEAT1 RNA 的 π target 探针。我们的 π-FISH rainbow 明确地证明了 MAPK15 和 NEAT1 的空间共定位信号（Fig. 4g）。为了进一步测试 π-FISH rainbow 多重同时检测 DNA、RNA 和蛋白质的能力，我们检测了 HeLa 细胞中 lncRNA NEAT1、Pol II 蛋白和 MAPK15 基因组位点的空间分布（Fig. 4h）。这些不同生物分子的高质量 FISH 信号表明 π-FISH rainbow 在多组学研究中具有广泛的潜在应用。
5. 开发 π-FISH+ 以检测 microRNA、选择性剪接变体和短 DNA 位点
目前的 FISH 方法需要目标区域的长度约为 500 bp，以便为多重探针提供足够的空间，从而产生强杂交信号。通过一对探针以足够的信号强度和特异性来检测短长度靶标（例如 microRNA、选择性剪接变体和短 DNA 基因座）仍然具有挑战性。因此，我们开发了 π-FISH+，它将 π-FISH rainbow 与 HCR 技术相结合，仅使用一对 π target 探针即可实现密集扩增。如 Fig. 5a 和 Supplementary Fig. 13 所示，π-FISH rainbow 步骤 4 中的信号探针被 HCR split-initiator 探针和自折叠发夹取代。每个三级扩增探针与四对 split-initiator 探针杂交。因此，π-FISH+ 使用一个 π target 探针理论上可以引发 64 个 HCR 反应，产生足够的信号放大用于检测和成像。
a. π-FISH+ 示意图：将 π-FISH rainbow 信号探针替换为 HCR split 探针进行杂交链式反应，进一步放大信号。
b. π-FISH+ 仅通过每个基因的一对 π target 探针共同检测 miR145-5p 及其海绵 lncRNA MALAT1。Scale bar, 5μm。
c. 用于识别 ARV7 剪接变体的探针设计图：可以通过同时标记基因座 1（在 ARV1、ARV2、ARV4、ARV7中）和基因座 2（在 ARV5 和 ARV7 中）来识别变体。K19 基因的信号用作内部对照。
d. 前列腺癌细胞系 LNCaP（表达 ARV7）和 PC3（不表达 ARV7）中基因座 1（洋红色）、基因座 2（红色）和 K19（绿色）的联合检测。作为对照，K19 在两种细胞系中均表达。虚线表示细胞边界。Scale bars, 5 μm。
e. (d) 中 LNCaP（顶部）和 PC3（底部）细胞中 ARV7 信号的 3D 渲染图像。ARV7 的阳性信号用黄色点表示。Scale bars, 5 μm。
f. 应用 π-FISH+ 检测 CTCs 中的 ARV7，以在前列腺癌治疗期间进行临床诊断。
g. 在前列腺癌患者血液的 CTCs 中成功检测到 ARV7 变体。Scale bar, 2.5 μm。
h. 用于检测小基因组插入缺失和断点的探针设计图。设计一对 π target 探针以定位基因座 1 作为参考，另一对设计以定位断点、基因座 2。使用 CRISPR/Cas9 系统敲除 A549 细胞中 12 号染色体中的 DNA 序列：40360484–40361854 生成 A549-KO 细胞系。
i. 对应于基因座 1（绿色）和基因座 2（红色）的信号在 A549 野生型 (A549-WT) 细胞中重叠，而在 A549-KO 细胞中仅检测到基因座 1。虚线表示细胞边界。Scale bars, 2.5 μm。
为了验证信号强度和荧光点大小的变化，我们使用一对 PPIA π target 探针进行 HCR 扩增 1、2、4、8、16 小时，以生成不同的扩增聚合物（Supplementary Fig. 14a）。HCR 放大 16 小时可在不增加光斑尺寸的情况下产生最大信号亮度，这意味着它可用于 π-FISH+ 检测（Supplementary Fig. 14b, c）。值得注意的是，我们发现所有反应时间的变异系数相似，表明 HCR 扩增程度不会影响点的亮度（Supplementary Fig. 14d）。值得注意的是，PPIA 的 π-FISH+ 信号具有高度特异性，因为在阴性对照中几乎没有检测到噪音信号（Supplementary Fig. 14e）。为了计算假阳性率，我们使用 π-FISH+ 在 HeLa 细胞中共同检测了 PPIA 和细菌 dapB（真核生物中不表达），结果发现假阳性率为 0.36%（Supplementary Fig. 14f, g）。π-FISH+ 的检测效率与 π-FISH 相似（Supplementary Fig. 14h, i）。然而，该点的荧光强度明显高于 π-FISH rainbow 的荧光强度（Supplementary Fig. 14j）。
我们首先应用 π-FISH+ 检测 miR145-5p 及其海绵 lncRNA MALAT1。由于 miR145-5p 仅包含 23 bp 种子序列，因此将 54 bp ssDNA 延伸探针与种子序列杂交，以为 π-FISH+ 扩增系统产生足够的空间。54bp 延伸探针被证明对于 miR145-5p 检测是必需的且具有特异性，因为对于无探针或乱序延伸探针对照来说，噪声信号可以忽略不计（Supplementary Fig. 15a–c）。此外，π-FISH+ 验证的 MALAT1 表达模式与 π-FISH rainbow 结果一致，进一步证明了 π-FISH+ 策略的效率和准确性（Supplementary Fig. 16a, b）。π-FISH+ 联合检测显示细胞核中聚集的 MALAT1 与 miR145-5p 共定位（Fig. 5b and Supplementary Fig. 16c）。
先前的研究表明，前列腺癌患者 CTCs 中雄激素受体剪接变体 ARV7 的表达与雄激素受体 (AR) 靶向治疗的先天性和获得性耐药性相关。尽管已经进行了大量尝试来在蛋白质或 mRNA 水平上区分 ARV7 与其他剪接变体，但这些方法的效率和准确性仍然不明确。因此，我们应用 π-FISH+ 通过使用两个荧光信号探针同时标记 ARV7 基因座 1（ARV1、ARV2、ARV4、ARV7 中的转录本）和基因座 2（ARV5 和 ARV7 中的转录本）来鉴定 ARV7。在这种情况下，当两个荧光信号共定位时，获得了与 ARV7 相对应的特定信号（Fig. 5c）。为了测试这一点，我们检查了两种成熟的前列腺癌细胞系 LNCaP（表达 ARV7）和 PC3（不表达 ARV7）中的 ARV7 和 K19（CTCs 标记物）。如 Fig. 5d, e 所示，ARV7 在 LNCaP 细胞中明确观察到，但在 PC3 细胞中几乎不存在。为了验证 π-FISH+ 在临床诊断中的能力，我们进一步将 π-FISH+ 应用到前列腺癌患者血液中的 CTCs 中，并成功检测到 ARV7 变体（Fig. 5f, g and Supplementary Fig. 17），表明该抗雄激素治疗耐药性诊断策略的完整性。
此外，我们应用 π-FISH+ 来检测小的基因组插入缺失和断点。为此，我们通过 CRISPR/Cas9 系统敲除了 A549 细胞中 12 号染色体上的 DNA 序列：40360484–40361854，并生成了 A549-KO 细胞系。接下来，设计一对 π target 探针以定位基因座 1 作为参考，另一对设计以定位断点（基因座 2），如 Fig. 5h 所示。我们的数据表明，对应于基因座 1 和基因座 2 的信号在 A549 野生型 (A549-WT) 细胞中重叠。在 A549-KO 细胞中，仅检测到参考绿色荧光信号点（Fig. 5i）。这些结果表明，π-FISH+ 可仅通过一对 π target 探针来检测小 DNA 插入缺失和断点，并可能用于快速、直接的遗传性疾病诊断。
讨论
FISH 是分子生物学研究和精准诊断不可缺少的经典方法。尽管该技术最近得到了升级，但新一代尖端 FISH 技术仍处于起步阶段。在这里，我们开发了 π-FISH rainbow，一种具有高强度信号和低背景噪声的高效多重 FISH 方法。该方法已成功应用于单独或同时检测多种生物大分子（DNA/RNA/protein）和神经递质。此外，我们将 π-FISH rainbow 与 HCR 相结合，开发了 π-FISH+ 技术来检测短核酸片段，例如 microRNA 和转录本变异体。这些方法可广泛应用于动物、植物和病原微生物，为临床诊断和生物学研究提供有力手段。
为了提高杂交稳定性和效率，我们对传统的 split 探针进行了升级，在中间键区添加了 2-4 个互补碱基对，以形成更稳定的结构。我们的数据表明，π-FISH rainbow 确实可以促进杂交，并显着提高从高表达管家基因（例如 ACTB）到低表达基因（例如 MTOR）的信号效率和特异性。与 HCR 和 smFISH 相比，π-FISH rainbow 信号强度和荧光点计数明显更高。尽管 RCA 也可以产生高强度信号，但复杂生物组织中高效的酶促反应效率仍然是一个挑战。以前的 FISH 方法仅识别出 lncRNA MALAT1 的两种亚细胞定位模式，即在细胞核或细胞质中。由于 π-FISH rainbow 的高灵敏度，我们发现了 MALAT1 的一种新的亚细胞分布模式，在细胞核和细胞质中均呈低表达，展示了 π-FISH rainbow 在基因转录研究中的强大功能。虽然每个基因 1-5 个探针对足以检测高丰度转录本，但我们建议使用 10-15 个探针对来检测中等或低表达的转录本。
尽管 FISH 技术最近取得了进展，但它们需要长核酸片段用于每个位点的多重目标探针才能产生足够强的信号。检测 microRNA、选择性剪接变体和 DNA 插入缺失仍然是一个巨大的挑战。对此，我们开发了 π-FISH+ 方法，将 π-FISH rainbow 与 HCR 技术相结合，以实现足够的扩增能力，同时保证信号特异性。我们的数据表明，π-FISH+ 可以有效检测 miR145-5p 的分布及其与其靶标 lncRNA MALAT1 的共定位。我们还使用 π-FISH+ 验证了 CRISPR 编辑生成的 A549-KO 细胞中短 DNA 插入缺失的丢失，支持其在小片段 RNA/DNA 检测中的稳健性。值得注意的是，我们成功地将 ARV7 与其他剪接变体区分开来，这对于临床前列腺癌治疗期间的精确诊断是非常需要的。原则上，π-FISH rainbow 还可以与其他方法相结合来放大信号强度，例如 SABER，使其成为在各种平台上研究空间基因表达的灵活工具。
生物大分子（例如，蛋白质、RNA、DNA）或神经递质经常相互作用形成复合物，以精确的时空方式发挥其生理作用。描绘不同生物大分子复合物的具体空间分布和内容对于理解各种生物过程的调节至关重要。尽管许多 FISH 方法可以共同检测 DNA、RNA 和蛋白质，但这些方法依赖于多轮杂交、成像和比对。因此，迫切需要一种高效、准确的一步成像同时检测基因组位点、RNA 转录本和蛋白质的方法。为此，我们采用 π-FISH rainbow 方案进行蛋白质、RNA 和 DNA 联合检测，并证明了 Pol II、NEAT1 及其调控基因组靶标 MAPK15 基因的共定位。这种联合检测方法可以为生物分子相互作用之间的关系提供重要的见解，并阐明其调节机制。此外，π-FISH rainbow 具有通用性，并且与其他成像技术高度兼容，例如使用生物素化番茄凝集素进行血管标记，揭示了脉管系统、少突胶质细胞和神经元的全面空间分布。凭借 π-FISH rainbow 的稳健性，预计该方法将广泛与其他成像技术（例如 Ca2+ 成像和拉曼成像）结合，以破译多维空间组学。
单细胞测序的迅速出现已经产生了关于具有不同标记基因的新细胞类型亚群的前所未有的信息。具有中等通量的高度灵敏且经济高效的 FISH 方法可以提供充足的机会来描绘各种器官中细胞类型的空间景观。在这里，我们使用 π-FISH rainbow 来绘制不同亚层中不同神经元亚型的空间分布，通过 π-FISH rainbow 解码 scRNA-seq 数据中 21 个标记基因的空间分布。我们的数据表明，π-FISH rainbow 和 scRNA-seq 数据的集成分析可广泛用于组织中细胞类型的原位注释。在这里，我们在两轮中仅破译了 21 个基因作为概念证明。通过更多轮的杂交应该可以检测到更多的基因。为了进一步提高通量，π-FISH rainbow 可以通过具有不同 DNA 条形码的探针进行扩增，并在前瞻性研究中通过原位测序或多重顺序杂交进行解码。通过这种方式，π-FISH rainbow 将实现指数级更高的通量，同时保持其灵敏度和稳健性。
总体而言，我们开发了一种高效、多功能且稳健的多重 FISH 方法，即 π-FISH rainbow，具有高强度信号和低背景噪声。我们展示了这种强大的 FISH 方法在动物、植物和病原微生物中的应用。值得注意的是，π-FISH rainbow 可用于可视化染色体空间构象并共同检测多种生物大分子（DNA/RNA/protein）和神经递质，这可能极大地有助于破译细胞内分子复合物的分子机制和调控机制。通过将 π-FISH rainbow 与 HCR 相结合，我们实现了短核酸片段的检测，例如 microRNA 和前列腺癌抗雄激素治疗耐药标记物 ARV7 剪接变异体。我们的研究为多种生物分子的原位检测提供了强大的工具，可广泛用于各种生物学研究和临床诊断。
注：本文为个人学习笔记，仅供大家参考学习，不得用于任何商业目的。如有侵权，请联系作者删除。
本文由 mdnice 多平台发布
扫一扫
9202
被折叠的 条评论
为什么被折叠?
到【灌水乐园】发言
