【QIIME2】DADA2&Deblur

Deblur使用序列错误配置文件将错误的序列与从其来源的真实生物序列相关联，从而得到高质量的序列变异数据，主要为两个步骤。

DADA2:
质控（汇总版）：

qiime dada2 denoise-single \
  --i-demultiplexed-seqs mjsample.qza \
  --o-table table.qza \
  --p-trim-left 20 \
  --p-trunc-len 400 \
  --o-representative-sequences rep-seqs.qza \
  --o-denoising-stats stats-dada2.qza \
  --p-n-threads 10

重要输出文件：
table.qza 特征序列丰度表
rep-seqs.qza特征序列文件
stats-dada2.qza质控、去噪、去嵌合体后剩下的序列文件#查看每个样品剩余有效序列数（丰度表）

质量控制：

time qiime dada2 denoise-single \
  --i-demultiplexed-seqs demux_seqs.qza \
  --p-trunc-len 150 \
  --o-table dada2_table.qza \
  --o-representative-sequences dada2_rep_set.qza \
  --o-denoising-stats dada2_stats.qza

生成统计结果：

qiime metadata tabulate \
  --m-input-file dada2_stats.qza \
  --o-visualization dada2_stats.qzv

生成特征表摘要：

qiime feature-table summarize \
  --i-table dada2_table.qza \
  --o-visualization dada2_table.qzv \
  --m-sample-metadata-file metadata.tsv

生成代表序列摘要：

qiime feature-table tabulate-seqs \
  --i-data dada2_rep_set qza \
  --o-visualization dada2_rep_set.qzv

Deblur:
按测序碱基质量过滤序列

time qiime quality-filter q-score \
  --i-demux demux_seqs.qza \
  --o-filtered-sequences demux-filtered.qza \
  --o-filter-stats demux-filter-stats.qza

输出结果文件:
demux-filtered.qza: 序列质量过滤后结果;
demux-filter-stats.qza: 序列质量过滤后结果统计。

deblur去噪16S过程，输入文件为质控后的序列，设置截取长度参数，生成结果文件有代表序列、特征表、样本统计:

time qiime deblur denoise-16S \
  --i-demultiplexed-seqs demux-filtered.qza \
  --p-trim-length 150 \
  --o-representative-sequences rep-seqs-deblur.qza \
  --o-table deblur-table.qza \
  --p-sample-stats \
  --o-stats deblur-stats.qza \

可视化输出文件:

time qiime metadata tabulate \
  --m-input-file demux-filter-stats.qza \
  --o-visualization demux-filter-stats.qzv

time qiime deblur visualize-stats \
  --i-deblur-stats deblur-stats.qza \
  --o-visualization deblur-stats.qzv

time qiime feature-table tabulate-seqs \
  --i-data rep-seqs-deblur qza \
  --o-visualization rep-seqs-deblur.qzv

time qiime feature-table summarize \
  --i-table deblur-table.qza \
  --o-visualization deblur-table.qzv \
  --m-sample-metadata-file metadata.tsv

如果使用deblur-16S，deblur执行初始的正向过滤步骤，其中它丢弃与85% GreenGenes 数据库中OTU的序列小于60%相似性的任何序列。如果不想执行此步骤，请使用deblur-other方法。
deblur目前只能对单端序列进行去噪。如果提供末合并的双端序列为输入，将对反向序列不作任何操作。请注意，deblur接受合并的序列，并将它们视为单端序列，因此如果使用deblur进行去噪，需要先合并读取。