10X空间转录组重点分析合集3

作者，Evil Genius

国庆第一天，我们不搞新的，来一篇大盘点，盘点的内容包括以下的几点，包括应用与技术，大家也要随时进行总结。

之前总结过两篇，放在这里，希望大家一起学习，多多交流

10X空间转录组重点分析合集2

10X空间转录组重点分析合集

这一篇合集包括的内容如下：一些内容是总结，另外一些是运用场景。

• 空间转录组数据分析方法最新进展
• 空间转录组技术在肿瘤免疫治疗中的应用潜力
• 空间高变基因
• 空间转录组聚类方法讨论（重点在BayesSpace）
• 利用空间转录组技术探索组织结构
• 单细胞空间联合分析合集（重点介绍国产软件STRIDE & DSTG & SpatialDWLS & stereoscope）
• 空间转录组数据集分析转座因子表达

第一章，空间转录组数据分析方法最新进展

空间转录组学是一个迅速发展的领域，有望以单细胞或亚细胞分辨率全面表征组织结构。计算方法的发展对从原始数据中提取生物信号起着重要作用；下游分析工具将空间组织和细胞间通信描述为可量化属性，并提供算法来推导此类属性；集成管道进一步将多个工具组合在一个包中，使生物学家能够方便地从头到尾分析数据。

近日，来自美国的研究人员在《Genome Research》发表Perspective，总结了空间转录组数据分析方法和管道的最新进展，并讨论了它们如何在不同的技术平台上运作。

• 注：不同于综述文章，Perspective中的描述和观点会相对主观。

无论目前空间转录组技术的差异如何，空间转录组分析的共同目标是连接和整合来自基因表达和细胞或转录位置的信息。这对于提取有用的生物信息、与细胞形态联系以及产生新的假设至关重要。

对原始空间转录组数据进行预处理

空间转录组学分析方法概述

从空间转录组数据中识别细胞类型

细胞类型识别和定位可能是空间转录组数据分析的最基本任务。

利用空间转录组数据进行细胞类型鉴定的策略

如果数据具有单细胞分辨率，例如在multiplexed FISH方法中，无监督聚类与手动或自动注释相结合是以无偏方式识别细胞类型的常用方法。由于细胞类型识别不需要空间信息，因此该任务与scRNA-seq分析非常相似，已经为其开发了许多方法，例如Louvain、Leiden clustering是细胞类型识别的常用选择，其中聚类结果被用作初始指导，随后通常是繁琐的手工注释或自动分析流程。

当数据不足以以无偏的方式发现未知细胞类型时，研究人员通常会利用额外的scRNA-seq分析对基因特征已知的细胞类型进行注释。虽然最简单的方法是确定基因特征具有最高相关性的细胞类型，但缺点是它不能将细胞类型标记基因与转录组背景区分开来。为了优化精度，已经开发了许多计算方法，例如一种方法是基于scRNA-seq数据建立一个支持向量机分类器，但只使用来自seqFISH中也被分析的基因子集的信息。也可以使用似然比检验。重要的是，需要跨平台归一化来校准从不同技术检测到的信号。更普遍的是，可以估计和减少平台特有的技术变化。此外，已经开发了贝叶斯模型，以考虑细胞分割不确定性对细胞类型注释的影响。

商用的基于阵列的空间转录组技术（如10x Genomics Visium和NanoString GeoMx）通常没有单细胞分辨率。由于基因表达谱的变化可能与细胞类型组成的变化相关，而不是与新的细胞类型相关，因此不适合将聚类算法直接应用于此类数据并将产生的聚类解释为细胞类型。此外，只有在已知潜在基因表达特征的情况下，才有可能估计细胞类型组成。有两种估计细胞类型组成的一般方法：第一种方法是评估细胞类型特异性标志物在每个点的表达基因中的富集程度；第二种方法去卷积，旨在定量地估计每个位置不同细胞类型的比例。许多去卷积方法已经被开发出来，并为RNA-seq数据分析提供了基准。原则上，这些工具也可用于空间转录组分析，但考虑到空间转录组数据具有某些独特的性质。因此，使用为空间转录组分析量身定制的方法通常更准确，例如RCTD、stereoscope、Cell2location、SpatialDWLS、SPOTlight等。

研究细胞类型定位的一种补充方法是使用scRNA-seq数据作为起点，然后基于与空间表达谱的相似性重构空间信息。随着空间转录组技术在过去几年中的快速发展，现在可以直接测量空间信息，并进一步与scRNA-seq数据集成以进行进一步完善。因此，较新的方法以更平衡的方式集成scRNA-seq和空间转录组数据，例如一个平台无关的相互最近邻算法(MNN)已被用于对齐这些数据类型，从而形成细胞位置映射；DEEPsc使用人工神经网络来预测空间位置；GLUER结合NMF、MNN算法和深度神经网络来对齐数据，Tangram对齐scRNA-seq和空间转录组数据集，同时优化scRNA-seq数据和空间数据中每个基因的空间相关性（类似的方法还有NovaSparc和D-CE），Tangram对齐的确定性模式也可以作为一种去卷积方法。

表征转录组谱的空间模式

空间模式分析

空间转录组分析的关键贡献不仅在于描述细胞类型，还在于描述它们的空间组织方式。这对于研究组织结构和细胞-细胞相互作用的影响至关重要。可以使用成对富集分析（pair-wise enrichment analysis）来识别可能相邻的细胞类型对。细胞领域模式分析可识别多细胞类型邻域的重复模式。另一种识别富集模式的方法是使用topic models。此外，细胞状态的连续性可以被纳入隐马尔科夫随机场（HMRF）模型，以识别连贯的空间域。BayesSpace使用来自空间邻域的信息来增强空间转录组数据的分辨率并进行聚类分析。而SPICEMIX将HMRF与NMF相结合。staNMF将NMF与稳定性准则研究相结合，识别空间模式。

许多工具根据预先定义的过程对基因表达的空间模式进行建模，例如spatialDE、SOMDE、Trendsceek、SPARK、binSpect等。其中，作为一个具体的例子，binSpect被用来识别MERFISH冠状脑切片数据中具有空间一致性模式的基因，排名靠前的基因显示上图F。

亚细胞结构分析

亚细胞分辨率的空间转录组学分析示意图

随着新技术的进步，现在可以实现亚细胞转录物的研究。除了基于FISH的方法（众所周知这些方法具有单分子分辨率），ISS方法也提供非常高的分辨率。此外，高密度阵列或基于珠子的技术还实现了亚细胞分辨率。

已经开发了许多方法来使用亚细胞基因表达模式来规避细胞分割，例如SSAM、stLearn、Spage2vec等。基于已知细胞类型特异性特征的监督细胞类型映射策略已经开发出来，例如使用朴素贝叶斯模型为HDST数据分配细胞类型。亚细胞基因表达模式反过来可以用来改善细胞分割，例如Baysor、Sparcle、JTSA等。

对基因表达的亚细胞模式的分析也可以提供新的生物学见解。例如已经开发了一种原位RNA速度方法，以使用亚细胞RNA定位信息来推断转录率。

此外，通过使用过氧化物酶APEX2（一种称为APEX-seq的方法）对RNA进行直接邻近标记，可以高分辨率地识别细胞质中的共定位mRNA物种。此外，在核位置富集的mRNAs倾向于编码在核斑点和核质中富集的蛋白质。或者，也可以通过ATLAS-seq检测亚细胞RNA共定位。

了解细胞如何与组织环境沟通

从配体-受体相互作用推断的细胞通讯

空间转录组分析的一个重要目标是研究细胞如何与组织环境通信。Giotto引入了一种双向比较方法，通过比较同一细胞类型内但被不同相邻细胞包围的细胞亚群之间的基因表达模式来识别相互作用改变的基因。值得注意的是，与单独使用基因表达信息相比，使用空间信息可以显著减少假阳性配体-受体活性预测的数量。CellPhoneDB v3.0中使用了类似的方法。为了克服空间转录组数据没有单细胞分辨率这一挑战，研究人员应用Cell2location来推断不同细胞类型的位置，然后比较与不同细胞邻域相关的基因表达模式。其他方法也被用来量化相邻细胞类型的影响，包括convolutional neural networks、optimal transport和multioutput regression。另一种方法是将基因表达谱明确分解为空间和非空间成分，然后利用邻域的细胞类型组成来估计空间成分。配体-受体相互作用的分析也被扩展到包括多单位蛋白复合物中辅助因子的影响，以提高预测的准确性。值得注意的是，还开发了从细胞-细胞相互作用模式重建空间位置的算法。

用于空间数据分析和可视化的综合探索性工具

交互式探索性分析管道的概述

生物学家将受益于集成和交互式管道，允许他们执行各种分析步骤，从原始数据导入到图像分析，然后生成最终分析结果和可视化图像，这些操作最好是在个人计算机上完成。目前，有许多综合工具包可用，例如Giotto、Seurat、Squidpy等。

这些软件包或工具箱大多是由独立的实验室开发的，这就导致了多个不同的数据结构不一定共享相同的数据格式。为了克服其中的一些挑战，R/Bioconductor社区正致力于精心设计普遍适用的数据结构，并在最近发布了spatialExperiment类的第一个版本。这是一个新的S4类，扩展了流行的singleCellExperiment类，旨在与几种类型的空间转录组数据集一起操作，包括多细胞和亚细胞分辨率。已经有几个空间R包使用这种数据结构，如SpatialLIBD和Spaniel，它们都擅长于创建交互式R/Shiny应用程序来可视化空间转录组数据集。

近年来空间组学领域取得了很多进展。新的方法已经被开发出来以应对各种特定的空间转录组挑战。综合性的软件包使生物学家能够轻松地从头到尾分析他们自己的数据，并通过交互式可视化对数据进行互动探索。这些工具在使空间转录组技术广泛适用方面发挥了重要作用。

近年来，出现了一种范式的转变，即根据转录组图谱对细胞类型进行分类，有时还辅以其他分子模式。由于ST技术的快速发展，现在可以对同一细胞同时进行转录组分析和形态学分析，从而为系统研究这两种根本不同的方法之间的关系提供了很好的机会。

一个研究的新方向是空间多元组学。新技术的发展使得在保存蛋白质和RNA、内含子和成熟mRNA、DNA和RNA等信息的同时，可以分析同一细胞中的多种形态信息。这些技术使分析不同分子模式之间的相关性成为可能，并提供了机理上的见解。分析这些数据需要开发新的计算方法和工具包。

第二章，空间转录组技术在肿瘤免疫治疗中的应用潜力

肿瘤内异质性对癌症患者的准确诊断和个性化治疗策略的制定提出了重大挑战。此外，这种异质性可能是治疗耐药性、疾病进展和癌症复发的基础。虽然免疫疗法可以获得很高的成功率，但选择压力加上肿瘤内部的动态进化推动耐药克隆的出现，使肿瘤在某些患者中持续存在。为了提高免疫疗法的疗效，研究人员已经使用空间转录组技术来识别并随后阻断肿瘤异质性的来源。

原位杂交

原位杂交(ISH)是一种使细胞或组织中特定DNA或RNA分子可视化的分子技术。ISH是基于DNA/DNA或DNA/RNA双链的互补性，将标记的核酸探针原位杂交到目标上。通过这种方式，我们可以获得有用的空间信息。

荧光原位杂交

FISH是检测微生物、诊断实体瘤和血液瘤以及指导癌症治疗的有效临床工具。例如，FISH通常用于检测慢性髓系白血病中的BCR-ABL1 t（9；22）易位和各种癌症中的许多融合基因。FISH还被用于确认乳腺癌中HER2基因的扩增，从而确定最有可能受益于曲妥珠单抗（一种抗HER2的单克隆抗体）治疗的患者。另一个重要的例子是在非小细胞肺癌中检测EML4-ALK融合基因。随着越来越多的免疫疗法被开发和批准，研究人员试图用FISH来预测癌症免疫治疗的反应性。为了扩大FISH的有效性，可以将FISH与IHC或IF结合起来，同时检测不同细胞类型的RNA和蛋白质，以更好地表征肿瘤微环境（TME）。

smFISH和RNAscope

为了解决传统FISH的局限性，研究人员从研究DNA转移到研究单分子RNA，并采用高通量的方法，由此产生了smFISH技术，其能够可视化和量化单个mRNA分子，并表征内源性基因表达的空间模式。通过靶向细胞mRNA而不是DNA分子，smFISH已经成为评估肿瘤内转录异质性的有力工具。

RNAscope是一种商业化的基于ISH的技术，可以检测多达12个不同的RNA靶点，并且可以方便地与IHC和/或IF结合，以自动化的方式同时研究RNA和蛋白质。相对于其他基于FISH的技术，RNAscope已经设计了13000个以上的RNA探针，并通过商业化的流程进行验证。因此，它是一种用于基础研究和临床实验的省时和友好的方法。RNAscope已经广泛应用于各个学科，包括传染病、癌症、免疫治疗、炎症和神经科学。特别是，它是IHC的一种强有力的替代方法，可以评估各种实体瘤中免疫检查点的表达，如PD-L1。通过检测特定RNA，RNAscope阐明了TME、免疫逃逸机制以及新的预测和预后癌症生物标志物。

在免疫疗法的背景下，RNAscope在理解CAR-T细胞疗法方面发挥了宝贵的作用。RNAscope已被用于评估靶基因表达的特异性，并跟踪CAR-T细胞在异种移植小鼠模型中的分布。扩展到人类样本，已有研究验证了BCMA的表达是多发性骨髓瘤CAR-T细胞免疫治疗的靶点。

Multiplexed smFISH

尽管可以从RNAscope等技术中获得更高的灵敏度和特异性，但最终需要基于FISH的技术，允许进行高通量转录组分析，以更好地表征显示独特基因表达谱的稀有细胞群和细胞类型。MERFISH和seqFISH，不仅提供了改进的RNA定量、信号放大和检测，而且提供了基于图像的转录组分析。

MERFISH从smFISH改良而来，采用了基于条形码的组合标记方法，然后进行多轮杂交，以确保荧光信号的高亮度和一次可检测到的大量RNA。

MERFISH原理

seqFISH是另一种基于连续几轮条形码杂交标记的Multiplexed smFISH技术。例如，seqFISH被用来对小鼠胚胎干细胞和脑组织中>10000种mRNA进行成像，具有较高的准确性和分辨率。相关研究已证明seqFISH是研究和获得T细胞成熟过程中调控基因表达动态的有力工具。另一项研究将微流体技术与Multiplexed smFISH技术结合起来研究乳腺癌中的肿瘤异质性证明，Multiplexed smFISH可以从不同角度进一步优化。

尽管smFISH技术前景广阔，但由于探针设计、验证、图像分析和解码的复杂性，基于smFISH的复合技术尚未广泛应用于转化研究或临床应用。使用非多重FISH、定量PCR、IHC和IF在mRNA或蛋白质水平上研究单个基因的表达通常更为方便，尤其是当研究的基因数量较少时，如一组预后标志物。另一个限制是，由于序列杂交的性质，总成像时间加起来至少为18小时，还不包括最初的36~48h的探针杂交时间，因此与其他技术相比（如DSP和Visium），总体通量较低。此外，Multiplexed smFISH技术只能评估新鲜冷冻组织中一种类型的分析物，如RNA。新兴的技术如DSP，可以评估新鲜冷冻组织和病理学常规使用的标准福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中的蛋白质和RNA。

不同成像方式的概述和比较

DSP

DSP是一种高复杂度的空间分析方法，其克服了Multiplexed smFISH技术的主要限制。DSP使用寡核苷酸检测技术来量化FFPE组织样本中的蛋白质或RNA。

用于RNA靶标检测的DSP原理

与顺序杂交技术（如MERFISH）不同，DSP提供了更高效的工作流程，可在48小时内从10~20个组织切片或多达384个目标区域产生结果。此外，与只分析RNA的Multiplexed smFISH相比，DSP可以同时检测96种蛋白质或1400个mRNA。这一特征与癌症免疫治疗特别相关，因为mRNA和蛋白质表达模式的差异可用于阐明转录后调控和翻译后修饰，从而导致蛋白质不稳定，影响预后和治疗反应。同时，DSP还保存了组织样本的完整性，可以储存珍贵的样本，并用于将来的进一步分析。

DSP在免疫治疗领域有着广泛的应用，例如已有研究用DSP评价了接受化学免疫治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的免疫微环境；DSP在免疫检查点阻断治疗方面也有研究，包括抗PD-L1和抗PD-1治疗。DSP可以作为一种辅助诊断工具，对TME中空间定义的区域内PD-L1蛋白表达进行标准化、定量和客观评估。在另一项研究中，DSP成功地识别了20种以上的生物标志物，这些标志物可以预测黑色素瘤患者对免疫治疗的反应。

空间转录组技术（ST）

在单细胞RNA测序过程中，由于组织通常被均质化以获得转录组的平均概况，造成空间信息丢失。最近，空间转录组技术（Spatial Transcriptomics）被开发，该技术利用空间条形码寡脱氧胸腺嘧啶微阵列实现完整组织切片中的转录组定量可视化和分析。

这项新技术首先在小鼠嗅球上得到证实，并遵循如下标准工作流程：组织切片、固定、苏木精和伊红（H&E）染色、亮视野成像、组织渗透、cDNA合成、组织切除、探针释放、文库制备、测序、数据处理、数据可视化和分析。

通过ST对乳腺癌、前列腺癌和皮肤恶性黑色素瘤活检的数据分析显示，肿瘤内和肿瘤间的异质性达到了前所未有的水平，以及通过RNA测序分析和/或标准形态学注释，注释肿瘤区域和外周之间的基因表达谱存在明显差异。此外，利用这种技术进行的体内实验已经发现了通过重新增殖小胶质细胞诱导IL-6信号，这在治疗方面可能有价值。

为了利用ST的潜力，研究人员最近开发了一种称为MIA的分析方法，其整合了单细胞RNA测序和ST技术产生的数据集，将细胞定位到组织上特定的区域。作为概念证明，MIA是在胰腺导管腺癌的数据集上进行的，并且揭示了特定的细胞类型和亚群在空间限制区域的富集，这些区域以前是未知或不可检测的。

基于空间转录学的概念，10× Genomics发布了Visum空间基因表达解决方案，与ST技术的第一次迭代相比，它具有更高的分辨率和更高的灵敏度。其被用于深入研究与组织结构和功能相关的疾病，除了用于癌症免疫治疗外，还可以用于神经系统疾病。