反向蛋白阵列（RPPA）简介

蛋白质组（proteome）是指在特定时间空间中，一个基因组、一个细胞或一种组织中表达的全部蛋白质。应用各种技术对蛋白质表达水平（定性、定量）、结构、功能、活性（修饰状态）以及相互作用关系进行大规模的研究的学科称之为蛋白组学（proteomics）。因为mRNA表达水平不能完全体现蛋白质的实际表达水平，而且提供较少的关于蛋白质-蛋白质相互作用和细胞信号通路的状态的信息，因此蛋白组学研究是对基因组学、转录组学等研究的有力补充。根据其研究内容可分为表达蛋白质组学、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。功能蛋白质组学旨在揭示蛋白质间的相互作用、建立细胞内信号转导通路的相互作用网络图。常用研究技术包括：酵母双杂交系统、免疫共沉淀、等离子表面共振技术、蛋白芯片、反向蛋白阵列（reverse phase protein assays，RPPA）。其中反向蛋白阵列技术因其高通量定量、高敏感性、能够检测翻译后修饰的特点在功能蛋白组学研究中广泛使用。本文将对RPPA技术的原理、实验流程及数据分析流程作简要说明。

1. 概述

Paweletz等人于2001年首次提出Reverse phase protein microarray（RPPA/RPMA）。“反相”指的是被抗原（被检测蛋白）作为捕获分子被固定，而不是将抗体作为捕获分子（基因芯片将探针固定）。RPPA是一种基于抗原-抗体结合原理的高通量功能蛋白组学技术，用于蛋白质定量和蛋白质翻译后修饰状态识别（如乙酰化、磷酸化、糖基化等），以此评估信号通路活性状态。

2. 优势与局限

（1）优势

• 高灵敏度
  • 可从纳克（ng）级别的蛋白质裂解液中探测阿克（ag）级别的特异蛋白。
  • 需要更少的样品：RPPA只需要数千个细胞，而Westen blot（WB）需要十万个细胞；每个样本40ul即可满足200种抗体的检测（实际所需细胞数量要考虑蛋白丰度和抗体的质量）。
• 高精确度
  • 连续稀释的实验设计保证定量的稳定性和精确性。
• 高通量
  • 可同时检测超过1000个样本，200种蛋白。
• 经济

（2）局限

• 只能检测已知蛋白
• 实验流程耗时

3. 基本原理

RPPA的基本原理与Western Blot和ELASA相似，当获取细胞、组织样本后，配置裂解缓冲液以获得蛋白裂解液，按照不同稀释浓度（不稀释，1/2，1/4，1/8，1/16）于微量滴定板上（如96孔板）加入蛋白裂解液，并转移至固相支持物（硝酸纤维素涂层的玻片），玻片上的目标蛋白首先由一抗特异性捕获，随后带有荧光或酶标记的特异性抗体作为探针，与一抗结合，越高的蛋白浓度结合更多的酶，此时加入酶的底物进行显色反应，显色强度与蛋白浓度呈线性或逻辑斯蒂关系，通过专业图像分析软件检测荧光强度或显色程度，建立信号强度-蛋白相对浓度曲线，从而实现蛋白的相对定量。当微孔板上设计有已知蛋白浓度的对照组，可实现绝对定量。

4. 实验流程

实验阶段的主要目的是为了提取可用于RPPA的蛋白裂解液、并通过免疫印迹的原理测定蛋白含量和修饰状态。大致步骤可分为取样、蛋白分离（提取）、蛋白阵列准备、转模和染色五个步骤。蛋白表达谱在取样前后可能会发生变化，为了减少变量的影响、保证RPPA实验获得可靠的结果，国际标准组织（ISO）制定了冰冻组织或FFPE（formalin-fixed and paraffin-embedded）组织从收集到储存的一系列标准工作化流程，包括样本收集、运输、处理、蛋白分离（蛋白裂解液制备）、分离蛋白的存储等。实验流程如下所示：

（1）取样

RPPA的样本来源广泛，主要包括细胞系和组织样本两大类，如冰冻组织、FFPE、血浆、体液、细胞培养裂解液、用细针吸器或激光捕获显微切割（LCM）获得的细胞等。不同类型的样本处理方法略有不同。

（2）细胞富集

来源于组织的样本在蛋白分离之前，首先需要富集感兴趣细胞，如在肿瘤组织中，不仅包含肿瘤细胞，而且含有间质细胞、免疫细胞等正常细胞，为了降低这些正常细胞对分析结果的影响，富集这一步骤必不可少。一般来说，数千的细胞数量可满足分析需求，但需考虑目标蛋白的丰度或抗体的性能。人工显微切割和激光辅助的显微切割是较为常见的富集方法。人工显微切割时，需要参考染色切片，从未染色的组织切片中刮取。该方法具有快速、经济等特点，适用于感兴趣细胞较为集中的情况。激光辅助显微切割包括红外捕获系统（infrared capture systems）和紫外切除系统（ultraviolet cutting systems）。两者的原理不大相同。前者（如LCM）通过破坏细胞间的黏附性，将组织解离为一个个小的细胞团。而后者则是通过直接破坏感兴趣区域周围的细胞，达到富集的目的。

（3）蛋白提取

蛋白提取在于获得样本中表达的所有蛋白质。对于FFPE样本，需通过一定步骤去除石蜡。Becker推荐使用Addis等人于2009年提出的“二甲苯去石蜡 + 系列梯度乙醇再水合”的方法。

用于蛋白质提取的裂解缓冲液，可自配Laemmli缓冲液，也可使用全蛋白酶抑制剂片whole proteinase inhibitor tablets）。去除石蜡的样本置于含提取缓冲液（Extraction Buffer，EXB）的收集管中，经孵育、离心，取上清液得到蛋白裂解液。蛋白裂解液可在4 ℃冰箱中保存1周，若需长期保存，应等分保存于-20 ℃冰箱中，按需而取，避免重复冻融。得到的蛋白裂解液需通过SDS-PAGE对蛋白质量进行验证。

（4）蛋白阵列制备

首先准备不同稀释程度的蛋白裂解液，通常包括5种稀释比例（未稀释，1/2，1/4，1/8，1/16）。根据实验设计（样本数量、重复次数、阳性对照、阴性对照），准备微量滴定板（如96孔）置于冰上，将所有样本同一稀释比例的蛋白裂解液集中滴加到实现划分好的区域内。

（5）转模

使用Aushon Biosystems 2470 arrayer将蛋白阵列转印到硝酸纤维涂层的玻片上。根据MDMD Anderson Cancer Center的工作流程，每一张玻片上可设置1056个样本，可划分为48个11× 11的亚阵列。亚阵列的每一行可以设置两个样本，按照五种蛋白浓度递减排列，这样两个样本需占据10个位点因此11行的亚阵列可以设置22个样本，第11列用于设置阳性或阴性对照。

（6）染色

蛋白质的定量基于免疫原理，通过酶标抗体或荧光标记抗体特异结合待检测蛋白，着色的深度或荧光的强度与蛋白浓度呈线性关系，通过与标准信号强度-蛋白浓度曲线比对（取信号强度与蛋白浓度曲线的线性部分），实现蛋白相对定量和绝对定量。染色一般步骤包括过氧化物酶活性抑制、一抗孵育、二抗孵育、信号放大以及显色（发荧光）。

以酶标抗体和荧光标记抗体染色的技术分别称为显色染色（chromogenic staining）技术和荧光染色（fluorescence staining）。两种技术各有优缺点。显色染色技术更为经济，敏感性高。相对于显色染色技术，荧光染色技术的荧光强度与蛋白浓度具有更强的线性关系，不产生有毒终产物。但是，硝酸纤维膜的自荧光将对背景信号产生影响，而且需要专业的图像扫描仪。

5. 数据分析流程

数据分析流程包括蛋白阵列图像扫描、信号强度定量、数据质控、数据标准化与归一化、构建信号强度-蛋白浓度曲线等。MD Anderson Cancer Center将RPPA数据分为Level 1 ~ Level 3，Leve l为从MicroVigene等软件中得到的原始信号强度txt文件，Leve 2为经过数据标准化，去除了背景噪声、空间效应的数据，Level 3为修正了蛋白浓度的数据、可直接用于下游分析。

（1）着色的蛋白质阵列扫描及信号强度检测（Level 1）

用平板扫描仪扫描蛋白阵列玻片，得到16位灰度图像，保存为TIF格式，将图像导入专业的RPPA图像处理软件（如APA、MicroVigene软件），输出信号强度相关数据（.txt 文件），如染色点的平均强度、平均背景强度、点的位置、点的净平均强度（= 平均点强度-平均背景强度）

（2）蛋白阵列质控

根据Akbani介绍，可通过四种指标综合评估蛋白阵列的质量，从而计算总质控分数（overall quality control scores），不符合要求的阵列应该剔除。

1. 信号强度取值范围：因为设置了5种蛋白浓度梯度，且每张玻片可能会检测多个样本的不同蛋白质。
2. 小的背景/信号比：背景/信号比 < 1 表示该点质量好，也可通过背景/信号比 < 1的点数占所有点数的比值来评估。
3. 测量阳性对照组之间的变异：阳性对照组之间应该具有相同的信号；按照稀释比例，每两个点之间的浓度应相差两倍。
4. 变异系数（Coefficient of variation，CV)：阳性对照组每一稀释比例间的CV，理论上应等于零。5种稀释比例对应五个变异系数，然后取平均值。

另外，Ju等提出为每张玻片计算一个质量控制指标来确其质量，取值范围为0 ~ 1，取值越大，质量越好。当该指标取值为0.8 ~ 1时，才被保留做进一步分析。

（3）数据标准化

数据标准化一方面旨在清除某些外在因素（如背景信号、空间效应）对蛋白表达水平的影响，另一方面是为了获得一个单一且确定的值表示某蛋白的表达水平（因为在每种蛋白具有五种不同的稀释程度）。

在实验设计时，会设计技术重复（重复3次以上为好）、阴性对照和阳性对照组。阴性和阳性对照组用于修正背景信号和空间效应（spatial effect）。在阴性对照中只添加缓冲液或者不加一抗，以此抵消缓冲液等试剂对蛋白浓度的影响。空间效应是指在染色点的间区因二抗等试剂与硝酸纤维膜非特异性的结合，造成染色点周围明、亮不一的现象。根据Neeley等研究，背景修正能在一定程度上抵消空间效应，但不足以完全抵消，需要设置阳性对照组进一步消除。这里的阳性对照组设置为系列稀释的含感兴趣蛋白的裂解液。另外，对于技术重复所产生的阵列，选用QC评分更高的进一步分析（Level 2）。

在理想情况下，同一稀释水平的样本点之间应具有相同的总蛋白浓度。然而，实际中可能因为混入其他非蛋白质物质造成总蛋白浓度发生变化，从而蛋白定量结果不准确。invariant protein method和median centering method两种方法可对总蛋白浓度修正（Level 3）。

（4）构建信号强度-相对蛋白浓度曲线

SuperCurve 或RPPanalyzer软件利用上步经修正和标准化的净平均强度联合样本的系列稀释度，构建强度（y-轴）- log2化的相对浓度曲线（x-轴），可采用参数（如logistic曲线）或非参数（线性模型）的数学模型拟合曲线。若设有已知蛋白浓度的对照组，可实现绝对定量。

（5）批次效应的处理

来源于不同实验室或者不同时间地点的数据，想要合在一起分析，需要去除批次效应。

• variable slope normalization（VSN）：不同实验室的数据集之间因为存在批次效应，强度-相对蛋白浓度曲线的斜率往往不同。假设蛋白强度的分布在不同的阵列中相同，通过建立模型将每一数据集的斜率转变为同一斜率，从而实现批次效应的去除。
• replicates-based normalization（RBN）：该方法要求对每一蛋白裂解液实现几次技术重复，修正批次效应时，将其中一个重复（D1）作为参考，对其他重复（D2）进行修正。首先分别计算D1和D2数据集的均值和标准差，通过将D2数据集加上D1和D2均值之差，再乘以D1和D2标准差之比，使得D1和D2数据集均值和标准差相同。

6. 应用

（1）细胞系

• 不同培养条件下细胞信号网络的特征
• 药物筛选
• 识别靶向治疗靶点
• 明确信号网络中的调控机制

（2）组织样本

• 药理学和生物相关剂量确定
• 预测靶向治疗后的预后或反应
• DNA、RNA和protein之间相关性
• 肿瘤分类

参考文献

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[2] Ju Z, Liu W, Roebuck P L, et al. Development of a robust classifier for quality control of reverse-phase protein arrays[J]. Bioinformatics, 2015(6):912-8.

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