非因解读 | RPPA蛋白组学全程助力三阴性乳腺癌治疗和研究

三阴性乳腺癌（TNBC）是一种高度侵袭性的乳腺癌亚型，具有明显的分子异质性，对荷尔蒙拮抗剂、赫赛汀等靶向药不敏感、预后差。目前，尚无有效的药物治疗靶标和先进的人类疾病临床前模型。

2021年8月法国马赛发育生物学研究所Maina团队联合波特兰奈特癌症中心Gordon Mills团队在《Advanced Science》（IF:16.806）杂志上发表题为“Modeling Heterogeneity of Triple-Negative Breast Cancer Uncovers a Novel Combinatorial Treatment Overcoming Primary Drug Resistance”的研究性论文(图1)，研究者基于野生型MET受体表达的水平增加会自发形成TNBC的研究基础，设计了TNBC研究模型（MMTV-R26Met小鼠）；利用RPPA蛋白组学技术结合机器学习，验证了该模型可重现人类TNBC的瘤间异质性；通过对模型靶向蛋白表达谱的分析筛选出TNBC的潜在治疗靶点，并最终发现BCL-XL和WEE1抑制剂联合使用是治疗TNBC的潜在方案。

图1

研究亮点

通过RPPA技术，绘制MMTV-R26Met肿瘤和细胞蛋白表达谱（247靶标），探究MMTV-R26Met肿瘤中蛋白表达/磷酸化水平的信号变化，发现MMTV-R26Met肿瘤和细胞均可精准地再现TNBC患者的异质性。

通过药物筛选，发现同时抑制BCL-XL和WEE1可显著降低肿瘤细胞活力；结合RPPA技术，通过对BCL-XL和WEE1抑制剂联合处理MGT细胞系进行表达谱的进一步绘制（426靶标），探究了药物作用机理，为TNBC识别出一种新型的药物组合疗法。

RPPA新型靶向蛋白组学作为一种高通量的多重蛋白靶点分析技术，可实现大规模样本的几百种中低丰度蛋白靶点和修饰靶点的平行分析；同时RPPA具有其它高通量蛋白组学所无可比拟的超高灵敏度，可在40微克总蛋白或15毫克组织中（米粒大小）分析＞300种中、低丰度蛋白，包括大量药物靶点、细胞信号蛋白、翻译后修饰蛋白（磷酸化，乙酰基化，甲基化）等。非因生物传承MD安德森癌症中心的价值和理念，已经开发了一整套包含几百个蛋白和磷酸化靶点的RPPA蛋白组学分析Panel——Cancer Signaling Pano-Profiler，非因RPPA新型蛋白组学技术在定量能力、重复性、大样本分析比对能力上的优势，是其它蛋白组学技术手段所不具备的。

研究思路

研究结论

1. 模型构建和肿瘤异质性验证

小鼠模型构建

通过MMTV-R26Met-Luc小鼠体内的生物发光成像和MMTV-R26Met小鼠的Q-PCR及免疫组化实验，研究者证实了转基因小鼠模型体内实现了乳腺的重塑（图2b），表明小鼠乳腺中Met水平的轻微增加足以触发TNBC的致瘤程序。组织学分析显示，MMTV-R26Met模型中的TNBC具有高度侵袭性和浸润性（图2e）。

图2

RPPA蛋白组学验证肿瘤异质性

研究者对MMTV-R26Met小鼠模型的肿瘤样本（n=24）和对照乳腺样本（n=3）进行反相蛋白微阵列（RPPA）蛋白表达图谱的分析（247靶标），结果显示MMTV-R26Met形成的TNBC可分成四个不同的簇，在信号水平及MET磷酸化水平存在异质性（图3a，3b；图S2d）。RT-qPCR结果也观察到Met转录水平的异质性，反映了TNBC患者中MET水平的异质性（图S2e）。利用TCGA数据库中TNBC数据，构建机器学习模型进行分析，研究者进一步证实了MMTV-R26Met模型包含TNBC的所有分子亚型（图3c，d）。

图3（左）+图S2（右）

2. 药物组合筛选

耐药研究

为研究对常规化疗药物和联合治疗药物是否具有原发性耐药，研究者从MMTV-R26Met肿瘤中建立了6种乳腺肿瘤（MGT）细胞系，并将细胞注射到裸鼠侧面皮下（n=4–5）。其中，MGT4、MGT9、MGT11和MGT13四种细胞系在体内表现出致瘤性，而MGT2和MGT7两种细胞系则没有（图4a，b），致瘤性MGT细胞系（MGT4、MGT9、MGT11和MGT13）对常规化疗药物（如多西他赛、顺铂、5-氟尿嘧啶）具有耐药性，并且仅部分对高剂量阿霉素敏感（图4g）。此外，所有的致瘤性MGT对先前报道的三种有效联合治疗TNBC方案（EGFR+MET、PI3K+MEK和EGFR+PYK2 图4h）也存在抗性。

图4

基于RPPA信号网络的药物组合筛选

研究者再次通过RPPA（247靶标）研究上述6种MMTV-R26MetMGT细胞系中的信号通路的变化。发现致癌亚型中与DNA修复、细胞周期调节和代谢相关的通路都显著富集（图5d；图S4b）。基于这些发现进行药物筛选实验，研究者发现BCL-XLi+WEE1i的联合使用，可有效抑制致瘤性MGT细胞系（图6c）。对所有人源TNBC细胞（6种）和人源非TNBC细胞（4种）的进一步研究（图6d）发现WEE1i对TNBC的具有特异性。

图5

图S4（左）+图6（右）

3. 基于RPPA的BCL-XL-WEE1轴作用机理探究

通过一系列小鼠成瘤实验验证药物组合的有效性后，研究者最后通过RPPA技术（426靶标）进一步分析了BCL-XL和WEE1抑制剂联合处理后MGT细胞内发生的信号机理变化。研究者观察到WEE1抑制后，磷酸化YCDK1（WEE1的直接靶点）、磷酸化SRB和CHK1表达水平降低（图7b和8a），伴随细胞在周期阶段分布的改变，如FACS曲线所示（图8b）。BCL-XLi+WEEi联合使用导致MCL1和XIAP抗凋亡信号的急剧下调（图7a、b和8a）。S1987ATM和S139H2AX（组蛋白变体，H2AX）的上调，反映出治疗后MGT细胞中DNA损伤水平的增加（图7a、b和8a；图S7a）。此外，研究者观察到RRM2急剧下调，组蛋白H3和H3K9me2水平上调（图7a-d；图S6b）及细胞染色质部分的pSRPA32增加（图8e）。致癌通路中MET和GAB1的磷酸化水平显著下调（图8a）。

图7（左）+图8（中）+图S7（右）

通过免疫细胞化学（ICC）技术，研究者发现γH2AX阳性细胞数量显著增加，反映出DNA DSBs（双链断裂）的积累（图9a）。这些发现与上述结果一致（图8a；图S7a），并反映了BCL-XLi+WEE1i联合靶向后高比例细胞DNA损伤的增加。此外，当接受联合治疗时，pH3阳性细胞显著增加（图9b），表明G2/M细胞比例较高，反映了WEE1抑制导致有丝分裂提前进入。最后，通过分别联合pan-Caspase抑制剂和ferroptosis抑制剂（图9e，f），进一步发现细胞的死亡方式为凋亡而非铁死亡。

这些发现表明BCL-XLi和WEE1i的联合用药，加剧了TNBC细胞对WEE1功能的依赖性，导致有丝分裂突变和凋亡。

图9

研究总结

在这项研究中，研究者开发了一种新的TNBC小鼠模型，重现了TNBC的异质性和原发性耐药。由于来源于MMTV-R26Met肿瘤的细胞保持同样的特性，所以研究者也构建了一个有价值的细胞模型，用于探究TNBC的分子特性，筛选治疗方案；同时通过与RPPA蛋白组学分析和TCGA数据库挖掘的结合，最终发现了BCL-XL+WEE1抑制剂联合用药是一种潜在的TNBC组合疗法。