动物线粒体基因组组装基本流程——GetOrganelle

一、线粒体基因组介绍

（一）基本介绍

大多数动物线粒体基因组为双链环状DNA分子（J链和N链)。非孟德尔遗传，一般为母系遗传。也有部分为父系遗传，例如哺乳动物中绵羊。动物的线粒体基因组一般15～20 kb。线粒体是古老的具有自主复制和遗传能力的细胞器。 重组是线粒体基因组进化的主要方式。动物线粒体基因组结构相对保守，基因排列紧凑，这些特点都跟植物叶绿体基因组相似。

图片引自《蝙蝠蛾鳞翅虫草Samsoniella hepiali模式菌株线粒体基因组系统发育分析》

（二）线粒体基因组的结构组成

基因组结构：双链编码基因(大多数动物通常包含13个编码蛋白质的基因）；rRNA和tRNA基因 。

动物：3′端有一段具有二级结构 的控制区（又称D一环区，displacement loop region）， 控制线粒体DNA 的复制和转录。这一区域多是串联重复序列，并在核DNA上有同源区。 它与转座、错配表达和线粒体基因组异质（heteroplasmy） 相关。

（三）生物学意义结构变异

进化关系的推断：通过同属/科/目物种线粒体基因组共有基因进行系统发育分析，得到整个种/属/科/ 目的进化情况

基因组重组和基因转移：线粒体基因组的结构变异可以涉及基因组重组和基因转移事件。这些事件 可以导致线粒体基因组的重塑和重组，从而在进化过程中产生新的线粒体基因组结构。

雄性不育相关基因的鉴定 线粒体基因组中的某些区域被认为与雄性不育相关，通过对具有雄性不育表型和正常育性表型的个体 进行基因组比较，可以鉴定与雄性不育相关的基因，并为雄性不育系育种提供理论指导和实践应用。

物种鉴定（高可变区等） 线粒体基因组具有高度可变的区域，如高变区，可以用于物种的鉴定和鉴别。

二、动物线粒体基因组组装策略

需要选择近缘物种的线粒体基因组或 部分片段作为参考序列从研究类群的 全基因组数据中捕获线粒体reads，软 件：GetOrganelle、NOVOPlasty等

三、实操

首先安装GetOrganelle软件

conda create -n getorganelle python=3.6.8
#创建getoganelle的环境，可通过python3 -V查看当前的python版本，使用系统中存在的python版本
conda install -n getorganelle -c bioconda getorganelle
#在miniconda3上安装getorganelle

 安装好软件后下载数据比对库，这里以动物线粒体基因组为例

get_organelle_config.py --add animal_mt

激活一下软件

conda activate getorganelle

到这里我们就可以使用这个软件进行组装了，如果测序数据比较大，我们可以截取一部分数据进行线粒体基因组的组装，如果数据少的话就不需要了，直接用全部。一般组装动物线粒体基因组数据2g左右就可以了，具体跟线粒体基因组含量，染色体基因组大小有关。

从总的clean data中提取部分数据 

head -n 20000000 data_R1.fastq > R1.fastq
head -n 20000000 data_R2.fastq > R2.fastq

用提取的部分测序数据进行线粒体基因组组装，命令如下：

get_organelle_from_reads.py -1 /mydataplace/R1.fastq -2 /mydataplace/R2.fastq -o GetOrganelle_out -R 15 -k 21,45,65,85,105 -F animal_mt

其中-1为5'端向3'端测得的序列；-2为3'端向5'端测得的序列，-o为输出的文件夹，-R为迭代循环次数，-k为打断成的kmer大小（为奇数，不能超过测序长度，例如pe150测序不能超过149），-f为组装的类型。另外，可以加入-s参数指定参考线粒体基因组（可以放入近缘种的做参考），-t参数来指定使用的cpu数量，更多参数可以去官网看一下。

组装完成后结果序列文件中如果有circular即是成环。

基本上这样就可以了，如果没成环可以调整一下-R、-k参数，或者用NOVOplasty以最长的contig为seed进行延伸（不建议用这个方法，因为可能有不定碱基或者gap的出现）。除非控制区特别长，或者样本有问题，一般二代就可以完成动物线粒体基因组组装。

四、总结

虽然植物线粒体基因组结构复杂，但对于动物来说，其结构还是较为保守的。总体来说动物线粒体基因组组装相对容易，唯一可能的难题就是控制区的组装，若控制区过长，还需设计引物来补齐缺口（极小一部分需要）。