EP | 南农赵方杰组揭示水稻根系多种内生菌对砷的转化

编译：微科盟Noria，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

在水稻田土壤中生长的水稻往往积累了大量的无机和有机砷，可能对植物造成毒性和对人类健康造成风险。土壤中砷的生物有效性和毒性取决于其化学种类，这些化学种类主要由土壤微生物驱动进行多重转化。然而，水稻根内内生菌在As种类转化中的作用仍不清楚。本研究通过盆栽试验测定了水稻根内圈和根际中与砷转化有关的微生物功能基因的丰度。我们还分离了46种不同的细菌内生菌，并测试了它们转化不同As种类的能力。砷酸还原酶基因arsC和异化砷酸还原酶基因arrA在根内圈的绝对丰度与根际相当，而亚砷酸甲基化基因arsM和亚砷酸氧化基因aioA在根内圈的绝对丰度较低。将细菌16S rRNA基因标准化后，所有4种As转化基因在根内圈中的相对丰度均高于根际。与功能基因数据一致，30株好氧内生菌均能还原As(V)，但只有3株能氧化As(III)。在16株厌氧内生菌中，4株属于脱硫弧菌属、Terrisporobacter或梭菌属的菌株可以甲基化As(III)或MMAs(III)。6株好氧内生菌能使MMAs(III)去甲基化，其中3株也可将MMAs(V)还原和去甲基化。所有分离株均不能使DMAs去甲基化。这些结果表明，生活在水稻根系内的多种内生菌可以参与As种类转化并影响水稻植株中As的积累和种类分布。

图文摘要

论文ID

原名：Transformation of arsenic species by diverse endophytic bacteria of rice roots

译名：水稻根系多种内生菌对砷的转化

期刊：Environmental Pollution

IF：9.988

发表时间：2022.7.20

通讯作者：赵方杰

通讯作者单位：南京农业大学资源与环境科学学院

DOI号：10.1016/j.envpol.2022.119825

实验设计

结果

1 土壤孔隙水和水稻植物中砷的种类

3种土壤的As含量为5.8~17.2 mg kg-1(表S1)，属于非污染土壤范围。土壤pH值在5.8~6.1之间。土壤有机碳含量变化范围为11.5-36.5 g kg-1(表S1)。盆栽试验在植物取样前采集土壤孔隙水。3种土壤孔隙水中均检测到无机As(As(III)和As(V))以及甲基化As(MMAs和DMAs)。As(III)为主要种类，占检测到As种类总数的52%~81%(图1a)。MMAs和DMAs分别占As种类总数的2~9%和3~31%，TC土壤的As甲基化程度高于其他两种土壤(图1a)。As(III)也是水稻根系和地上部检测到的主要As种类，分别占总数的66~81%和38~86%。As(V)分别占根系和地上部As总数的11~15%和11~25%。在地上部中检测到甲基化As种类MMAs和DMAs，分别占总As的0 ~ 21%和2 ~ 26%。在根中，MMAs和DMAs仅在来TC土壤样品中检测到，其含量也低于地上部(图1b和c)。

图1. 3种水稻土孔隙水(a)、以及三种水稻土壤栽培的水稻地上部(b)和根系(c)中砷的种类。数据为平均值±标准差(n = 4)。

2 内生菌与根际细菌组成

本研究发现获取水稻根系内生菌的方法不会对根际细菌造成污染，因为在有氧和厌氧培养条件下，灭菌根系的最终漂洗水都是无菌的(图S1)。采用荧光原位杂交技术(FISH)验证细菌内生菌的存在。在SHY土壤中生长的水稻根部的皮层和根柱中心内都能检测到细菌细胞(红色荧光)(图S2)。在没有Eub338探针的阴性对照中，未检测到红色荧光(图S2)。

细菌16S rRNA基因的定量PCR分析表明，3种土壤中内生菌的丰度(1.9 ~ 2.7 × 10¹⁰拷贝/克根干重)比根际细菌的丰度(4.4 ~ 5.4 × 10¹¹拷贝/克根干重)低一个数量级(图2a)。基于16S rRNA扩增子测序，分别在SHY土壤、TC土壤和SY土壤的水稻根内圈鉴定出1994、1366和1892个ASVs。这些ASV数量与根际相似，在SHY、TC和SY土壤中ASV的数量分别为1835、1577和1753。3种土壤水稻根部细菌内生菌共享138个ASVs，占总ASV的7 ~ 10%(图3a)。在SHY、TC和SY土壤中，根内圈和根际分别共享618、571和566个ASVs。此外，3种土壤中共有207个根际ASVs(图3b)。尽管ASV数量相近，但SHY土壤内生细菌群落的α多样性低于根际细菌群落且差异显著(图S3)。PCoA分析表明，土壤群落主要沿第2主坐标分离，而3种土壤主要沿第1主坐标分离(图S3)。

不同门、纲、目、科、属的ASV数量分别为99%、98%、90%、73%和53%。不同门的相对丰度在根际和根内圈之间存在显著差异。根内圈群落中厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteriota)的比例高于根际群落，而放线菌门(Actinobacteriota)、Myxococcota、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidota)和脱硫菌门(Desulfobacterota)的相对丰度低于根际(图3c-e)。

利用线性判别分析效应大小(LEfSe)方法，鉴定根际和内圈之间显著差异丰度ASV。与根际相比，SHY土壤、TC土壤和SY土壤中分别有23、23和29个ASVs显著(P< 0.05)富集于水稻根内圈。相比之下，分别有190个、121个和207个ASVs显著减少。3种土壤的内生菌群落共有2个富集的ASVs和13个减少的ASVs(图4a, b)，这表明这些ASVs是水稻植物特异性选择的。两种富集的ASV主要为Candidatus jidaibacter和鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)，减少的ASV主要为Gaiellales、Micrococcales、根瘤菌目、酸杆菌目、Ignavibacteriales和Ssteptosporangiales(图4c,d)。

图2. 分别测定了3种土壤水稻根内圈和根际细菌16S rRNA (a)、arsM (b)、arsC (c)、arrA (d)和aioA (e)基因的绝对丰度和相对丰度。相对丰度以16S rRNA拷贝数为基础表达。数据为平均值±标准差(n = 3)。

图3. 维恩图显示了3种水稻土壤中水稻根内圈(a)和根际(b)共有的扩增子序列变异(ASV)的数量。SHY(c)、TC (d)和SY (e)土壤水稻根系内生菌核心门。

图4. 与根际相比，SHY、SY和TC土壤中水稻根内圈共富集(a)和共减少(b)的ASV数量和ASV数量。富集ASV (c)和减少ASV (d)的分类鉴定。

3 土壤中砷转化基因的丰度

利用定量PCR技术对细菌16S rRNA、arsC、arrA、aioA和arsM基因在根际和内圈的丰度进行了定量分析。反映细菌种群的16S rRNA的绝对丰度(每克根干重的拷贝数)在根际比在根内圈高约一个数量级(图2a)。分别编码解毒和异化砷酸还原酶的arsC和arrA基因在根际和内圈的绝对丰度相当。亚砷酸氧化酶基因aioA和亚砷酸甲基化基因arsM在内圈的绝对丰度比根际分别低2.5 ~ 5.5和4.0 ~5.6倍。经16S rRNA归一化处理后，4个AS相关基因的相对丰度在根内圈显著高于根际(图2b-e)。

4 内生菌转化砷

为研究水稻根系内生菌是否可以转化As种类，从内生菌中分离到46株，其中30株为好氧菌，16株为厌氧菌。这些内生菌显示出不同的菌落形态和颜色(图S4)。它们具有系统发育多样性，属于25个不同的属，包括芽孢杆菌属(Bacillus)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、梭菌属(Clostridium)和脱硫弧菌属(Desulfovibrio)等(图5)。

测试了8种As转化类型，包括As(V)还原、As(III)氧化、As(III)或MMAs(III)甲基化、MMAs(V)还原或去甲基化、MMAs(III)去甲基化和DMAs(V)转化。所有30株好氧内生菌均能还原As(V)，其中25株在24 h内将10 μM As(V)完全还原为As(III)，其余5株菌株将28 ~ 90% As(V)还原为As(III)(表1)。在30株好氧内生菌中，只有3株能将As(III)氧化为As(V)，包括Paraburkholderia insulsa R2A TC-2S、Lysinibacillus pakistanensis LB P SY-4和Chryseobacterium sp. LB P SY-5(表1)。

没有一种好氧内生菌能够甲基化As(III)或MMAs(III)(表1)。4株厌氧内生菌，包括2株Desulfovibrio sp.，1株Terrisporobacter petrolearius SY-5和1株Clostridium amazonitimonense SY-3，能够甲基化As(III)或MMAs(III)产生DMAs(表2)。7天内，4种厌氧内生菌对添加底物As(III)和MMAs(III)的甲基化效率分别为6-16%和3-33%。3株好氧内生菌(Bacillus cereus R2A SHY-2，Paraburkholderia kirstenboschensis R2A SHY-3、Microbacterium aoyamense R2A SHY-6)均能将MMAs(V)和MMAs(III)去甲基化生成无机As；这些菌株也能够将MMAs(V)还原为MMAs(III)(表1)。此外，3株好氧内生菌(Bacillus tropicus LB P SY-1、Enterobacter quasiroggenkampii LB P SY-2、Paraburkholderia kururiensis ST P SY-4)能够将MMAs(III)去甲基化为无机As，但不能将MMAs(V)还原为MMAs(III)(表1)。一株分离株(Burkholderia seminalis ST SHY-1)能够将MMAs(V)还原为MAs(III)，但不能将MMAs(III)去甲基化(表1)。所分离的厌氧内生菌均不能使MMAs(III)或MMAs(V)去甲基化(表2)。此外，DMAs不能被任何好氧或厌氧分离株去甲基化(表1和2)。

图5. 基于水稻根系内圈16S rRNA基因的系统发育树。好氧菌和厌氧菌分别用蓝色和红色标出。

表1. SHY、TC和SY水稻土中水稻根内生菌对砷的转化。

表2. SHY、TC和SY水稻土中水稻根系厌氧内生菌转化砷的研究。

5 内生菌对植物生长的促进作用

30个需氧内生菌分离株中，2/3能产生植物激素IAA(表S4)；这些细菌属于芽孢杆菌属、伯克霍尔德菌属、微杆菌属(Microbacterium)、农杆菌属(Agrobacterium)、假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、Chryseobacterium、Pandoraea、Providencia、Priestia、克雷伯氏菌(Klebsiella)、Paraburkholderia、Lysinibacillus、肠杆菌属(Enterobacter)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomona)。12个菌株均可产生嗜铁素，属于Paraburkholderia、Priestia、Lysinibacillus、Burkholderia、Bacillus、Providencia、Enterobacter、Pseudomonas和Chryseobacterium (表S4)。此外，Paraburkholderia、伯克霍尔德菌属和不动杆菌属的5个菌株能够溶解无机磷酸盐，而芽孢杆菌属、Priestia、Enterobacter、Chryseobacterium和Paraburkholderia的另外5个菌株可以利用有机磷卵磷脂(表S4)。

讨论

近年来，内生微生物组在植物生长和抗逆性中的作用越来越受到人们的关注。在本研究中，我们发现水稻根内圈和根际的ASV数量相当，虽然三种土壤的内生细菌的绝对丰度都低于相应的根际。尽管内圈和根际的细菌群落存在差异，但32 ~ 42%的内生ASV与根际重叠，表明相当一部分内生菌是从根际水平传播的。厚壁菌门、放线菌、变形菌门是3种土壤中水稻根内圈的优势菌门。同样，之前的研究报道了γ变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门在水稻内圈的优势。通过比较内生细菌和根际细菌的序列数据，我们在三种土壤中鉴定出与根际细菌相比显著共富集的Candidatus jidaibacter和鞘氨单胞菌属的2个ASVs。这些微生物可能是实验中水稻植株专门招募的，可能对宿主有益。与根际相比，在三种土壤中在内圈都减少的13个ASVs可能是难以在水稻根内定植或被水稻根选择性排斥的ASV。除了对16S rRNA扩增子进行高通量测序外，我们还从有氧和厌氧条件下的水稻根部分离了内生细菌。分离得到的30株内生菌大部分属于芽孢杆菌属、假单胞菌属、肠杆菌属和伯克霍尔德菌属。许多分离株能够合成IAA，产生铁载体，或增溶磷酸盐和卵磷脂。IAA和铁载体的产生以及磷的增溶被认为是促进植物生长的重要性状。有趣的是，分离到的18株内生菌为厌氧菌，属于梭菌属、脱硫弧菌属、Oscillibacter、Kineococcus、Lacrimispora、Terrisporobacter、Anaerocolumna、Tissierella和Sporichthya。虽然在本研究中没有分离出产甲烷菌，但此前一项基于16S rRNA和甲基辅酶-M还原酶(mcrA)基因测序的研究也表明，水稻根内圈中产甲烷菌的丰度相对较高，是严格的厌氧菌。这些结果表明，尽管水稻根部形成了通气组织，以促进空气从地上组织向根系扩散，但水稻根部仍存在厌氧内生菌。根内圈内可能存在厌氧微区。另外，厌氧内生菌可能已经进化出代谢途径以适应不同的氧化还原生态位。

微生物是土壤中As种类转化的驱动力。令人惊讶的是，很少有人知道内生菌在As转化中的作用。在本研究中，我们发现水稻根内存在多个参与As转化的微生物功能基因。arsC和arrA在内圈的绝对丰度与根际相当，而arsM和aioA在内圈的绝对丰度约为根际的三分之一。根据16S rRNA拷贝数分析，根内圈的细菌数量远远少于根际，因此arsC、arrA、aioA和arsM在内圈的相对丰度远远高于根际。这些结果表明，水稻根内圈内生菌比根际细菌具有更多的As转化基因。这种差异的一个可能解释是，水稻根系外质体中的As浓度可能高于根际土壤中的As浓度，因此需要更多的As相关基因来应对不断增加的As胁迫。在DNA水平上存在As相关基因并不一定意味着它们具有功能。为了确定内生菌是否能够转化As，我们测试了个体分离株转化不同As种类的能力。我们发现内生菌可将As(V)还原为As(III)。对于许多微生物来说，As(V)还原为As(III)是解毒的第一步，As(III)可以很容易地从细胞中挤出。即使在水稻根系暴露于As(V)的情况下，As(III)仍然是水稻木质部汁液中的主要As种类。这被认为是水稻根系中As(V)还原酶的作用，包括OsHAC1;1、OsHAC1;2和OsHAC4。水稻根系中存在的许多能够还原As(V)的内生菌可能也有助于根系中As(V)的还原和木质部液质中As(III)的优势。与As(V)还原相比，本研究分离的内生菌中As(III)氧化现象较少。As(III)氧化是由存在于周质中的AioAB复合物催化的，通常与反硝化等其他过程相结合。As(III)的氧化也被认为是一种解毒机制，因为它可以阻止毒性更大的As(III)进入细菌细胞的细胞质。与相对罕见的As(III)氧化相比，As(V)还原在内生分离株中普遍存在，这与定量PCR数据一致，表明根内圈中arsC和arrA基因比aioA基因更丰富。

近年来，微生物As甲基化和去甲基化引起了人们的关注，因为过量积累DMAs会导致水稻直穗病，并且发现高细胞毒性的DMMTA广泛存在于稻米中。MMAs和DMAs同时存在于3种土壤的水稻幼苗中。水稻根系中没有或只有少量的MMAs和DMAs，可能是因为两者都被有效地转运到地上部。在本研究中，我们发现4株属于脱硫弧菌属、Terrisporobacter或梭菌属的厌氧内生菌菌株能够甲基化As(III)或MMAs(III)。相反，没有一株好氧内生菌能够甲基化As(III)或MMAs(III)。虽然系统发育多样性的微生物可以甲基化As(III)，但我们最近的研究表明，厌氧SRB是驱动水淹稻田土壤中As甲基化的主要微生物群。可能一些厌氧内生菌也参与了As的甲基化和随后甲基化As物种在水稻幼苗和籽粒中的积累。与As甲基化相反，部分分离到的好氧内生菌菌株可以去甲基化MMAs(III)，而分离到的厌氧内生菌菌株不能。MMAs(III)去甲基化是由ArsI酶催化的，与MMAs相比，DMAs似乎更耐受去甲基化，因为没有一个分离菌株可以去甲基化DMAs。这种差异也可以部分解释为什么DMAs是水稻籽粒中主要的甲基化As种类。

结论

在本研究中，我们比较了三种水稻土壤中水稻根际和根内圈的微生物群落和As转化基因丰度。经细菌16S rRNA基因归一化后，As转化基因arsC、aioA、arrA和arsM在根内圈的表达量高于根际。从水稻根中分离到46株好氧或厌氧内生菌，发现它们具有转化不同As种类的能力。好氧内生菌对As(V)的还原能力较强。一些厌氧内生菌也发生As(III)和MMAs(III)甲基化，而一些好氧内生菌能够氧化As(III)或去甲基化MMAs(III)。这些结果表明，内生菌可能在水稻As种类转化过程中发挥重要作用。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0269749122010399

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