RNAseq数据分析--read比对

Bowtie比对

• tophat和Bowie是同一个作者，tophat调用了Bowtie比对。
• Bowtie1针对50bp以下的reads比较好，但不适合长度大于1k的片段，不支持空位比对，不支持压缩格式。
• Bowtie2针对50bp以上的reads比较好

Bowtie比对也是需要先对目标建立索引才能比对，建立索引需要使用Bowtie2的build工具。当建立完索引之后再比对即可，比对后可能生成sam文件。

• Bowtie软件和参数的使用可以查看教程。

sam文件格式

• 短序列比对需要记录的信息，如是否错配等
  
• 注释信息
  
• sam文件每一行的信息
• 比对质量，值越高越好，第5列
  
• 每行第二列
  
• 每行的第六列
  
• 每行第七列，指的是mate序列所在参考序列上的名称
• 每行第八列，mate序列在参考序列上的位置
• 空溢出片段的长度，当mate序列在本序列上有时，则该值为负值。
• 第10列为read序列，
• ASCII码合适的质量值（？）
• 通过第一列，第10列，第11列可以获取比对上的read序列
• 第12列比对的具体细节
  

samtools工具

• 针对sam或bam文件进行处理
• 本课程版本（0.1.19）

view sam转bam
sort 排序
merge 合并多个sam
depth 计算覆盖深度，要先sort
samtools faidx ref.fna 对目标序列建立索引
index 也是排序吗？？？
tview 需要先sort再index
mphilup 将每个位点比对细节信息整理出来

tophat比对工具

• 与bowtie同一个作者，Bowtie比对不了的发生可变剪接的读段。而tophat可以比对。
• 推荐下载编译好的版本，解压缩之后即可使用

-r/–mate-iner-dist 为成对的reads之间的平均inner距离，默认50

–library-type 选择文库的类型，如 链特异性文库
-G选项，输入的是GTF、GFF格式文件；tophat先拿到的是转录子，然后用bowtie将reads比对到提取的转录子数据中，不能比对到reads再比对到genome，比对上的reads再打断，转变为到genomics mapping，再融合新的mapping和junction作为最后的输出。（GTF或GFF的第一列注意和bowtie的参考序列要一致）
–fusion-search 保存融合信息（不太懂，用到再查吧）
-g/–max-multihits 保留结果的数目,即一个reads可能有多种比对结果，这里最后保留前多少个结果。默认为20
–mate-std-dev 验证距离的标准差
-a/–min-anchor reads的最小锚定长度，最小值为3
-m/–splice-mismatches 对于一个剪接比对，其在锚定区域能出现的最大不匹配碱基数目
-i/–min-intron-length 最小的内含子长度
–max-insert-length 最大的插入片段长度，默认为3
-p/ 线程数
–no-sort-bam 输出的bam文件不进行排序

插入片段大小为200bp，reads读长为70bp；那么reads的距离是200-70-70=60bp。

比对案例

链接：https://study.163.com/course/courseLearn.htm?courseId=1209594947#/learn/video?lessonId=1280040963&courseId=1209594947

• 通常需要的是reads唯一比对上的情况，在该行标志位NH:i:1.
• 但是由于存在可变剪接，一个reads通常比对到基因组的不同位置，所以NH:i:多，仍然是需要的样本
• 还可以设置比对结果的数目和根据比对结果的得分进行计算。