单细胞数据分析笔记整理

10X, smart-seq中count, tpm等区别联系

细节参看

关于单细胞TPM、Count数据的处理:https://blog.csdn.net/m0_58549466/article/details/125730805
10X基于droplet的方法进行测序，smartseq2基于96孔板，二者都属于二代测序，也就是边扩增边测序。
10X: 以10X的3’端测序为例，磁珠上有很多短序列（它们的cellular barcode是一样的，UMI各不相同），在PolyT结合mRNA的3’端PolyA之后，尽管转录本有长有短，但因为测序序列长度有所限制，这些转录本分子会在靠近3’端的地方随机打断（只留下最靠边的序列），所以10X的又叫做3’测序，UMI-based，测序深度较低，每个细胞只有一部分基因可以被探测到，但UMI的计数被认为是基因表达水平的直接体现。所以表达定量的多少和基因长度关系不大。另外，UMI的作用是消除PCR的扩增影响，只要是来源于一个转录本，不管扩增多少次，最后定量值只会加1。

传统二代测序/bulk测序：一个完整的转录本分子会被随机打断，转录本越长，片段会越多，而这些片段最终都会被测序。因为这个偏好，标准化的时候才需要考虑转录本长度的影响。
Smart-Seq2：基于96孔板，捕获full transcripts without UMI.结果和传统二代Bulk转录组的结果更为相似。把一个一个的细胞丢进孔里，在每一个孔里完成一个单独的pcr，测出来的东西全部都是这个细胞的，所以测序深度更深。由于pcr的原理，所以对高转录本会有额外的偏好。

TPM, FPKM, Count

10X: 数据为UMI count，不需要考虑基因长度的影响，但仍然需要考虑测序深度在不同细胞之间的差异. 具体方法是用该基因的UMI/该细胞的全部UMI，再乘以10000, 之后使用$log(x+1)$ (对应log1p(x))进行对数变换，得到TPM数据。
可以采用Seurat::LogNormalize(data, scale.factor = 10000, verbose = TRUE)Normalize count data per cell and transform to log scale.
对数归一化作用：1. 去偏度：不同细胞起始底物浓度不同，导致cDNA捕获或PCR扩增速率不同。原始表达量或高达上千，或只有几十，归一化可以去除细胞间与真实表达量无关的技术因素，方便后续比较。