10X genomics scRNA_Seq 原理概念解说

单细胞分离--测序原理

10X Genomics采用Drop-Seq技术， 横向孔道逐个导入凝胶微珠Gel beads，第一个纵向道输入细胞。当凝胶微珠和细胞碰撞会被吸附在微珠上，然后通过微流控技术运送到第二个纵向通道（“油管”）。这时就会形成一个个的油滴GEMs（一个油滴就是一个凝胶微珠，也就是一个单细胞），然后收集在EP管中。每一个凝胶微珠都布满了不同的Barcode和UMI连接的序列，然后再加上PolyT就形成了像“刺”一样的捕获抓手，随后细胞裂解，利用3'端 poly(A) 碱基互补特定抓取mRNA构建转录文库。据说可以7分钟内完成100~80,000个细胞的捕获

简而言之：一个油滴 = 一个细胞（单细胞） = 一个RNA_Seq

文库构建

 read1：主要用来定量

read2：真正需要测序的mRNA序列

Barcode：用于标记每一个细胞

UMI：标记每一个细胞当中的每一个转录本（即标记基因）

PolyT：用于捕获PolyA尾巴的mRNA，进行反转录反应

10X genomics单细胞测序通过Barcode来标记细胞，UMI 来标记转录本，这样与参考基因比对后就可以定量细胞以及基因的数量

备注：使用 UMI 计数方法（ UMI 计数，是指在建库过程中，通过在引物上，增加随机序列，则对于同一种 mRNA 连上同样的 UMI 概率几乎为 0，则我们可以忽略由于 PCR 造成的误差，对于一种 mRNA，测到的 UMI 数量可以近似看成 mRNA 的表达个数）

细胞的质控（非reads的质控）     

由于每个单细胞都是独特的，不可能开展重复实验并评估噪音。因此，必须采取一些质量控制手段，以确保数据的可靠性。专家建议，向每个细胞裂解液中加入已知序列和数量的合成mRNA，如外源RNA对照联盟（ERCC）开发的加标RNA（10X genomics 官网有提供ERCC相关的参考基因组下载）。这些RNA的读数将提供样本间差异的信息。

细胞的过滤（非reads的过滤）

根据基因的表达量等特征，对细胞进行过滤，通常的做法就是指定一个阈值，比如要求一个细胞中检测到的基因数必须大于100，才可以进入到下游分析，如果小于这个数字，就过滤掉该细胞。需要强调的是，在设定过滤的阈值时，需要人为判断，这样的设定方式会受到主观因素的干扰，所以往往都会指定一个非常小的过滤范围，保证只过滤掉极少数的离群值点。

细胞聚类

细胞聚类允许我们推断细胞类型。根据细胞基因表达谱的相似性对细胞进行分组，得到细胞簇。通过距离度量来确定表达谱相似性，通常将降维结果作为输入。相似性评分的一个常见示例是欧几里德距离，该距离在 PC 缩减的表达空间上计算。在R包Seurat中，不是直接对所有细胞进行聚类分析，而是首先进行PCA主成分分析，然后挑选贡献量最大的几个主成分（也相当于做了特征选择），用挑选出的主成分的值来进行聚类分析。聚类分析是下游分析的主要和首要步骤，因为聚类后，各个细胞就有了groupinfo（即标签），可用于后续的差异表达分析，找出各细胞组间显著差异的genes，然后做GO,KEGG富集分析。