关于单细胞TPM、Count数据的处理

今天正好看了一个很优秀的帖子答读者问(6)：单细胞TPM矩阵如何分析？，就着github写一点总结，方便以后自己处理TPM数据的时候用。

1.10X和smart-seq2的区别和联系

想要了解单细胞TPM的数据处理，对10X和smartseq2进行总结也很有必要。下面这个图出自张泽民 Direct Comparative Analyses of 10X Genomics Chromium and Smart-seq2的文章。可以直接的看到，10X基于droplet的方法进行测序，smartseq2基于96孔板，二者都属于二代测序，也就是边扩增边测序。

 其它文献也有总结：10X依赖chromium仪器，smartseq2依赖C1仪器

10X:以10X的3'端测序为例，磁珠上有很多短序列（它们的cellular barcode是一样的，UMI各不相同），在PolyT结合mRNA的3'端PolyA之后，尽管转录本有长有短，但因为测序序列长度有所限制，这些转录本分子会在靠近3'端的地方随机打断（只留下最靠边的序列），所以10X的又叫做3'测序，UMI-based，测序深度较低，每个细胞只有一部分基因可以被探测到，但UMI的计数被认为是基因表达水平的直接体现。

然后两边连上接头进行后续的测序步骤...

所以表达定量的多少和基因长度关系不大。另外，UMI的作用是消除PCR的扩增影响，只要是来源于一个转录本，不管扩增多少次，最后定量值只会加1。

传统二代测序/bulk测序：一个完整的转录本分子会被随机打断，转录本越长，片段会越多，而这些片段最终都会被测序。因为这个偏好，标准化的时候才需要考虑转录本长度的影响。

 smartseq2：基于96孔板，捕获full transcripts without UMI.结果和传统二代Bulk转录组的结果更为相似。把一个一个的细胞丢进孔里，在每一个孔里完成一个单独的pcr，测出来的东西全部都是这个细胞的，所以测序深度更深。由于pcr的原理，所以对高转录本会有额外的偏好。

 2.UMI,COUNT,TPM,FPKM...

TPM FPKM都是为了消除测序深度和基因长度影响的方法，区别仅仅是公式略有不同。

10X数据因为有UMI，不需要考虑基因长度的影响，但仍然需要考虑测序深度在不同细胞之间的差异，所以需要用函数LogNormalize（原理参考seurat-NormalizeData()源码解析 - 简书）进行处理，具体方法是用该基因的UMI/该细胞的全部UMI，再乘以10000，在按列LogNormalize后，又可以按行进行scale​（原理参考seurat-ScaleData()源码解析 - 简书）​，以去除极大值极小值基因对数据的影响。

以公众号推文的举例，想实现类TPM很简单，就可以把10X的数据转换为TPM

mat.tpm.like=as.data.frame(test.seu[["RNA"]]@counts) %>% apply(2,function(x){x/sum(x) * 10000})

github上https://github.com/satijalab/seurat/issues/668提到：

可以对TPM手动log化以后再做scaledata，而不再使用NormalizeData,因为二者的这个函数和TPM的计算原理是一致的，没必要二次使用。

github上https://github.com/satijalab/seurat/issues/747提到：

You have to replace your object@data slot with the desired gene expression matrix as follows: pbmc@data = log(x = norm + 1))我个人认为这里的norm就是对应得TPM，这句代码对应得就是所谓手动log化

part2再研究一下smartseq2和10X的数据整合，目标是可以灵活掌握这两种数据方式TPM,COUNT的使用和转化。

part3：上一个还没有研究清楚，但是今天看了10X的官网，自己以前都是称呼count，但实际上read count和UMI count是不一样的哦。10X的单细胞结果是UMI count

part4:2023.12.29更新。

首先明确一点，10X流程得到的结果并不需要对基因的长度进行矫正，所以也就不存在真正的“TPM”，我个人理解在10X流程中的矫正只存在“类TPM”矫正，那么不矫正基因长度的“类TPM”实际上就是“CPM”。这种“CPM”实际上就是Seurat常常在用NormalizeData()做的事。但还有一个不同，常规的“CPM”缩放因子应该是10^6，而NormalizeData()使用的是10^4，具体原因参考帖子。以及单纯的“CPM”矫正不带log处理，这个要视后面的需求而定