Mothur1进阶_走近Mothur，探索未知

Mothur是一款由密歇根大学微生物与免疫学系的Patrick Schloss教授及其研究团队共同研发的微生物群落生态学分析工具，具有开源、可拓展的特点，能够满足微生物群落生态学的生物信息学分析要求。

Mothur整合了dotur、sons、treeclimber、s-libshuff、unifrac等功能，主要用于形成OTU/ASV，进行系统发育分析、计算Alpha和Beta多样性指数等。相较于其他生物信息学软件，Mothur具有命令简单、易上手和易理解的特点。

读者可以在Mothur官网https://mothur.org/下载其Windows版，并利用官网免费提供的标准化操作流程及命令说明，输入相关命令运行该软件，处理扩增子序列数据。目前，Mothur能够处理各种测序平台产生的序列数据，具体包括：454个焦磷酸测序，llumina公司的HiSeq和MiSeq, Sanger测序法，以及PacBio和IonTorrent等代表的三代测序技术。

01数据分析准备

硬件配置：笔记本电脑联想小新Pro-13ARE 2020。其中，处理器：AMD R7-4800U 8核16线程；硬盘：512GB SSD；操作系统：Windows 10家庭中文版；系统类型：64位操作系统, 基于x64的处理器

数据下载：本教程所使用的数据是Schloss实验室用Illumina的MiSeq平台通过配对末端读取(PE reads)生成的16S rRNA基因序列，所采用的方法是使用index reads，在单次运行中同时处理大量样本（384个），将其应用于生成这些库最新的湿实验wet-lab 标准操作程序中以便于用户学习Mothur。下载地址：https://mothur.org/wiki/miseq_sop/

需要下载的文件：

来自schloss实验室的示例数据

https://mothur.s3.us-east-2.amazonaws.com/wiki/miseqsopdata.zip

基于SILVA的细菌参考比对

https://mothur.s3.us-east-2.amazonaws.com/wiki/silva.bacteria.zip

RDP训练集的Mothur格式版本（v.9）

https://mothur.s3.us-east-2.amazonaws.com/wiki/trainset9_032012.pds.zip

Mothur可执行文件

https://github.com/mothur/mothur/releases/tag/v1.45.3（网页生成的Mothur可执行文件下载链接属于临时链接，很快失效。这里仅提供下载网页地址）

我们也提供了以上4个文件永久有效的百度网盘下载地址：https://pan.baidu.com/s/1m7X7gXrrv1O0KSyCBgV1lA 提取码：1234

温馨提示：推荐使用电脑桌面端浏览器跳转下载！

注意：1.文件解压后，将Trainset9_032012.pds、silva.bacteria文件夹和Mothur可执行文件夹的内容移动到MiSeq_SOP文件夹中；

2.本实验是关于肠道微生物组的正常变化对宿主健康的影响。该实验欲探究的问题是：与第140天-150天检测到的微生物组相比，小鼠断奶后的前10天体重的快速增长是否影响了其微生物组的稳定性。分析的过程中将综合利用操作分类单元（OTU）、扩增子/精确序列变体（ASV/ESV）、phylotype和phylogenetic的组合来解决想要探究的问题。示例数据所包含的数据为：单只小鼠10个时间点（5个早期和5个晚期）的数据文件（the flow files），以及21株细菌的基因组DNA组成的模拟群体（Mock community）二次测序数据。

数据清单文件生成

MiSeq_SOP文件夹中的文件包含22个fastq文件，代表来自雌3和“1”模拟群落的10个时间点。其中HMP_MOCK.v35.fasta文件是以fasta格式排序的模拟群落中使用的序列。

最后有一个名为stability.files的文件，该文件的第一行如下所示：F3D0_S188_L001_R1_001.fastq和F3D0_S188_L001_R2_001.fastq，分别对应于第0天（即断奶当天）的雌性3。这些序列为250 bp，在16S rRNA基因的V4区overlap，该区域长约253 bp。

在Mothur中使用make.file命令创建此文件：

命令注释：make.file命令为序列的拼接(make.contigs)、创建输入文件。这个命令将多个文件连接起来并把结果输出到一个清单文件（stability.file）中。命令注释：make.file命令为序列的拼接(make.contigs)、创建输入文件。这个命令将多个文件连接起来并把结果输出到一个清单文件（stability.file）中。

输出文件：stability.file

stability.file：清单文件。第一列是样本的名称，第二列是该样本的正向读取名称，第三列是该样本的反向读取名称。可以使用make.file命令创建，也可以手动编辑：可以先新建文本文档（TXT），按照stability.files文件模板写好后，修改文件后缀为.files即可。

02知识小便签

序列与测序

高通量测序技术（High-throughput sequencing）：又称“下一代”测序技术（"Next-generation" sequencing technology，NGS），是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。目前有很多用于微生物群落多样性研究的高通量测序平台。

Illumina MiSeq：2011年，Illumina推出台式测序平台MiSeq，具有体积和通量小、价格低的特点。MiSeq便于扩增子和细菌样本测序，测序原理为四通道可逆性末端边合成边测序技术。读长：2×300bp；reads：5×106；通量：15GB；样本数量：在单次运行中可对96个样品进行多重分析。

16S rRNA：指原核微生物（细菌和古菌）染色体上编码核糖体（Ribosome）RNA的16S（S是沉降系数）小亚基（Subunit）的基因序列。16S rRNA基因普遍存在于细菌和古细菌中，具有多个拷贝数，全长1500 bp左右，其结构由9个可变区（Variable region）和10个保守区（Conserved region）交替组成。保守区有利于扩增引物的设计，可变区体现了物种间的进化差异。对16S rDNA某个可变区进行测序，可以用于研究环境微生物中细菌或古菌的群落结构多样性。

18S rRNA：编码真核生物核糖体小亚基的DNA序列，其中既有保守区，也有可变区（V1−V9）。

ITS：16S rRNA和23S rRNA基因间的转录间隔区，是编码核糖体RNA前体基因的一段，位于核仁区，多用来进行进化分析。

Index reads：为了区分两个方向的reads，其中一个测序引物前面要添加一小段index序列进行标记，具体来说就是加到Illumina测序接头上的，保证多个测序文库可以在同一个flow-cell上或者同一个lane上进行混合测序(multiplexed)。

湿实验标准操作程序（wet-lab SOP）：高通量测序实验室会购买核酸提取试剂盒、文库准备试剂盒、通用测序反应试剂盒等，或者自行设计富集区域，合成相应的引物探针等并且建立生物信息学分析流程。

干实验标准操作程序：“干实验”过程是高通量测序的一大特点。该过程由分析软件和算法组成，并且按照一定的流程进行。

扩增子结构

Barcode：样品标签，用于混池测序后区分序列来自哪个样本；

Primer：在16S/ITS/18S保守区设计的引物，用于扩增rRNA的部分高变区；

Amplicon：扩增的部分rRNA。

扩增子测序：对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行测序，分析序列中的变异。其原理是利用PCR的引物来扩增基因组的特定区域，靶向地捕获目标区域的DNA，达到目的DNA片段的富集目标，最后针对扩增产物（也被称为扩增子）进行高通量测序，分析序列中的遗传变异等信息的。

操作分类单元（OTU）：在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，种，属，分组等）设置的同一标志。

数据库介绍

Silva数据库：SILVA一词起源于拉丁文silva（意为forest），它是一个包含三域微生物（细菌、古菌、真核）rRNA基因序列的综合数据库，其数据库涵盖了原核和真核微生物的小亚基rRNA基因序列（简称SSU，即16S和18SrRNA）和大亚基rRNA基因序列（简称LSU，即23S和28SrRNA）。因为SILVA数据库更新比较及时，因此是目前rRNA基因高通量测序后最常选用的参考数据库之一。此外，与RDP类似，SILVA也可被用于平时菌种鉴定时，对少量rRNA基因测序后的物种进行分类鉴定，此时主要用其SINA Alignment Service功能，可非常方便地确定某条rRNA基因序列从门到属/种水平的分类信息并给出各分类水平相应的置信度。

RDP数据库：RDP数据库全称“RibosomalDatabase Project”，该数据库提供质控、比对、注释的细菌、古菌16S rRNA基因和真菌28S rRNA基因序列。RDP是目前较常用的rRNA基因高通量测序后作为比对、注释的参考数据库。此外，还可用于平时菌种鉴定时，对少量rRNA基因测序后的物种进行分类鉴定，此时主要用其Classifier功能，可以非常方便地确定某条rRNA基因序列从门到属/种水平的分类信息并给出各水平相应的置信度。

Greengenes数据库：Greengenes是专门针对细菌、古菌16S rRNA基因的数据库，相比前面提到的RDP和SILVA数据库，该数据库更新速度较慢，目前更新停留在2013年5月更新的gg_13_5版本，目前较常用于16S rRNA基因高通量测序后进行嵌合体去除的参比数据库。

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