Phenix图文流程：使用docking解决Cryo-EM数据的结构问题

翻译自：https://phenix-online.org/documentation/tutorials/cryo_em_structure_solution_docking.html

Tutorial: Solving a structure with cryo-EM data using docking

教程：使用docking解决Cryo-EM数据的结构

---

这个例子是cryo-EM map的密度修改density modification，然后是通过对接docking同源结构进行可选的结构确定。数据是载铁蛋白的half-maps (EMD entry 20026, 1.8 A)。 文件是：

emd_20026_half_map_1_box.ccp4 emd_20026_half_map_2_box.ccp4 -- half maps
seq.dat -- sequence file
20026_auto_sharpen_A.ccp4 -- deposited map, half-map sharpened
apoferritin_chainA_rsr.pdb -- model refined against sharpened map
1aew_A.pdb -- chain A from X-ray structure of horse apoferritin (53% identical to human
apoferritin)
run_denmod_dock.csh -- command file that will run all these things for you if you want

这些maps都是从存放的maps中cut out (boxed) 的(只是为了使本演示中的文件更小)。

A. DENSITY MODIFICATION OF HALF-MAPS

half-maps的密度修正:
要从命令行运行一个cycle of density modification，可以将其粘贴到终端窗口中。
在GUI中，只需设置所有相同的参数，而不需要设置output_directory(它将位于resolve_cryo_em_0或类似的目录名中)：

phenix.resolve_cryo_em emd_20026_half_map_1_box.ccp4
emd_20026_half_map_2_box.ccp4 resolution=2.2 dm_resolution=1.8 seq_file=seq.dat cycles=1
nproc=4 box_before_analysis=False output_directory=denmod
density_modify_unsharpened_maps=Trueinitial_map_file_name=initial_map.ccp4

大约15分钟后，这将(在resolve_cryo_em_xx目录中)生成文件：

denmod/denmod_map.ccp4 -- density-modified map密度修改map

您可能希望cut out与apoferritin_chainA_rsr.pdb匹配的map部分：

phenix.map_box ignore_symmetry_conflicts=true
apoferritin_chainA_rsr.pdb denmod/denmod_map.ccp4 prefix=denmod_map_A

因为denmod/denmod_map.ccp4的map可能与apoferritin_chaina_rsr.pdb中的map具有不同的“unit cell”，所以我们说“Ignore_Symmetric_Conflicts=True”。这里的“unit cell”只是对map中的box of
points的描述。它有时指的是原始map的大小，有时指的是map的工作部分的大小，该命令要求忽略这些差异。

在Coot或Chimera中，可以加载模型(apoferritin_chainA_rsr.pdb)，并将锐化的deposited map (20026_auto_sharpen_A.ccp4)与 density modified map(denmod_map_A.ccp4)进行比较。看看残基13和81以及残基161附近的主链，就可以看到map上有实质性改善的例子。

B. STRUCTURE SOLUTION BY DOCKING HOMOLOGOUS MODEL (horse apoferritin, 53% identical)

B.通过对接同源模型的结构方案(马载脂蛋白，53%相同)：
文件1aew_A.pdb包含1aew的X射线结构，1aew是一种来自马的同源蛋白(53%相同，rmsd 0.5A)。我们将把这个结构dock到我们的density-modified map中，细化它，固定序列，再次细化，然后使用density modify using the model，以获得最终的map。

1. Getting map symmetry We will want a symmetry file describing the symmetry operators that have been used in our map. We can get them automatically in about 30 seconds with:

1.获取map symmetry我们需要一个对称文件来描述我们的地图中已经使用的对称运算符operators。我们可以通过以下方式在大约30秒内自动获取它们：

phenix.map_symmetry denmod/denmod_map.ccp4 resolution=2
symmetry_out=denmod_map.ncs_spec

参考：

https://wenku.baidu.com/view/7da42e91f221dd36a32d7375a417866fb84ac0fe.html

现在，denmod_map.ncs_spec在该map的适当位置具有24个用于八面体对称的symmetry operators。

关于Symmetry：

2.Docking into density-modified map

2.dock到密度修改的map中
我们可以使用dock_in_map找到1aew_A.pdb在地图中的位置：

phenix.dock_in_map denmod/denmod_map.ccp4 1aew_A.pdb resolution=2 nproc=4
symmetry_file=denmod_map.ncs_spec pdb_out=1aew_A_docked_in_denmod_map.pdb

马上就会得到模型1aew_A_docked_in_denmod_map.pdb。

3. Cut out a piece of density-modified map and compare to docked model

3.切出一张密度修正后的map，并与docked model进行比较
您可以从密度修改后的贴图中切出一块，然后将其与此模型一起查看，如下所示：

phenix.map_box denmod/denmod_map.ccp4 1aew_A_docked_in_denmod_map.pdb
ignore_symmetry_conflicts=true

这将生成1aew_A_docked_in_denmod_map_box.ccp4和1aew_A_docked_in_denmod_map_box.pdb，您可以在Coot或Chimera中查看。请注意，许多侧链与密度不匹配，因为模型来自同源结构。

4. Refine the model against the density-modified map

4.根据密度修改后的map优化模型
我们可以根据原始map或cut-out map来优化docked model。让我们用cut-out map吧。我们也可以只优化A链或整个24-mer。
不同的是，如果你使用整个24-mer，你将包括inter-chain contacts。
如果你使用单一的链，你将忽略它们。现在让我们只使用一条链：

phenix.real_space_refine 1aew_A_docked_in_denmod_map.pdb 1aew_A_docked_in_denmod_map_box.ccp4
resolution=2 ignore_symmetry_conflicts=True

几分钟后，我们得到了输出模型：1aew_A_docked_in_denmod_map_real_space_refined.pdb。如果你在Coot或Chimera中观察这个模型，你会发现它已经将一些侧链移动到密度中，但它们仍然与密度不匹配，因为这个对接模型的序列不是人类载铁蛋白的序列(例如，看看R29，它应该是一个酪氨酸)。

5. Fix the sequence

修改序列
我们可以使用sequence_from_map重做docked model的sequence ：

phenix.sequence_from_map 1aew_A_docked_in_denmod_map_real_space_refined.pdb
1aew_A_docked_in_denmod_map_box.ccp4 resolution=2 seq_unique.dat nproc=4
pdb_out=1aew_A_docked_rsr_seq.pdb

几分钟后，您应该会得到文件：1aew_A_docked_rsr_seq.pdb ，其中包含mapped onto the real-space-refined model的人类载铁蛋白序列。

现在可以用Coot或Chimera来看看map。您可以看到一些侧链需要改进，P157的一个loop 需要移动。我们先来改进一下我们的新model吧。

6. Refine model with new sequence

我们可以像以前一样改进，但使用我们的新序列：

phenix.real_space_refine 1aew_A_docked_rsr_seq.pdb 1aew_A_docked_in_denmod_map_box.ccp4
resolution=2 ignore_symmetry_conflicts=True

再过几分钟，我们就有了refined model：1aew_A_docked_rsr_seq_real_space_refined.pdb。这个model非常符合map，但在P157处的loop仍way off。我们需要re-fit这个loop。

7. Fit a loop that is not in density

7.适合密度不大的loop
我们可以使用fit_loops 工具修复此循环。我们可以查看model和map，注意到模型中不符合的部分是残基155-159。让我们用以下方式解决这些问题：

phenix.fit_loops 1aew_A_docked_rsr_seq_real_space_refined.pdb
map_in=1aew_A_docked_in_denmod_map_box.ccp4 resolution=2 seq_unique.dat remove_loops=True
start=155 end=159 pdb_out=1aew_A_docked_rsr_seq_rsr_loop157.pdb

马上，这个链条的这一部分就会与密度相适应。

8. Refine model with fitted loop

使用fitted loop优化模型：
在P157处拟合我们的loop后，我们可以再改进一次：

phenix.real_space_refine 1aew_A_docked_rsr_seq_rsr_loop157.pdb 
1aew_A_docked_in_denmod_map_box.ccp4 resolution=2 ignore_symmetry_conflicts=True

现在我们有了1aew_A_docked_rsr_seq_rsr_loop157_real_space_refined.pdb。在Coot或Chimera看一看吧。

注意：文中插图为个人运算所得，仅做参考
此外文中个别参数在GUI界面没能找到（比如nproc）就没能输入，如果有知道的可以私信或留言，谢谢~

---