【无标题】

 

期刊：ISME             

影响因子：11.217           

发表时间：2022

客户单位：南京农业大学动物科学技术学院

近日，凌恩生物客户南京农业大学动物科学技术学院朱伟云教授团队在《ISME》发表题为“Amino acid utilization allows intestinal dominance of Lactobacillus amylovorus”的研究论文，该研究结果显示PBAAs利用能力的提高有助于淀粉乳杆菌的优势，表明氨基酸的利用是影响肠道微生物分布的决定性因素。

一、研究背景

哺乳动物的肠道中有不同分布的微生物，其中特定的类群（如乳酸菌）在哺乳动物中占主导地位。养分的有效性和利用性等确定性因素可能会影响微生物的分布。由于生理上的复杂性，营养利用与关键类群的优势之间的联系机制尚不清楚。淀粉乳杆菌是猪小肠中的优势种。

二、实验设计

图1 实验设计

三、结果分析

1、16S rRNA基因序列的测序质量

原始序列reads经过质量过滤，获得2,821,266条高质量序列（占总序列的88.90%），平均每个样本44,082条序列。测序深度几乎达到总微生物物种丰富度，几乎所有的稀疏曲线均接近饱和。

2、水解酪蛋白改变了不同肠道部位微生物组结构，并导致乳酸菌在小肠中占优势

加权UniFrac PCoA分析显示，不同肠段之间的总体微生物组成存在差异，这表明整个肠道的微生物群存在空间异质性。相比Casein-intact，Casein-pep显著改变了空肠、回肠和结肠腔内的微生物群组成（AMOVA p < 0.05，图2A），但在十二指肠中不显著。

图2 用完整酪蛋白或水解酪蛋白喂养的猪肠道微生物群的结构和组成

在分类学水平上，观察到Casein-pep组的空肠中乳酸杆菌的相对丰度（15-60%）和大肠杆菌的丰度均低于Casein-intact组（图2B,C）。Casein-pep组空肠中巨球型菌属和光冈菌属以及回肠乳杆菌属和放线杆菌属的相对丰度明显高于Casein-intact组。

总的来说，Casein-pep和Casein-intact对空肠和回肠微生物群的影响最大，乳酸杆菌属在整个肠道中受到了不同的影响。

3、水解酪蛋白增加了在空肠和回肠的食糜中的L. amylovorus和肽结合氨基酸

为了确定Casein-pep喂养对哪组乳酸菌的特异性刺激，采用qPCR方法进行了定量分析。结果表明，与Casein-intact喂养相比，Casein-pep喂养显著增加了空肠中乳酸菌的数量（p = 0.024，图3A）。在空肠和回肠中，与Casein-intact喂养相比，Casein-pep喂养的淀粉乳杆菌数量分别增加了近15倍（=0.023）和27倍（=0.021），表明Casein-pep喂养能刺激淀粉乳杆菌的生长（图3A,B）。

由于Casein-pep喂养和Casein-intact喂养为细菌生长提供了重要的氮底物，进一步测定了肠道食糜中游离氨基酸（FAA）和肽结合氨基酸（PBAA）的浓度。在空肠中，Casein-pep组的PBAA水平显著高于Casein-intact组（p = 0.046，图3C），而在回肠中，Casein-pep组的PBAA含量较Casein-intact组有增加的趋势（p = 0.072，图3D）。空肠和回肠两组间FAA水平均无差异。综上所述，Casein-pep饲粮增加了小肠食糜中PBAAs的浓度和淀粉乳杆菌的数量，说明多肽底物可能导致淀粉乳杆菌的生长优势。

图3 细菌数量和肽结合氨基酸的测量

4、从基因组特征推断的淀粉乳杆菌S1的鉴定及其整体氨基酸利用

接着研究人员从小肠空肠中分离出淀粉乳杆菌，以确定酪蛋白饲料对其的影响。通过选择单菌落，分离出一个淀粉乳杆菌菌株S1（图4A）。S1的16S rRNA基因序列与微生物组测序得到的具有代表性的16S rRNA基因序列100%一致（图4B）。

为了更好地了解AA和肽利用的功能潜力，进行了全基因组测序。L. amylovorus S1的全基因组序列由一个环状染色体（2091784 bp）和两个环状质粒（分别为67799 bp和39117 bp）组成。L. amylovorus S1基因组包含2232条蛋白编码序列，GC含量为38.33%，其中包含65个tRNA基因和15个rRNA操纵子。氨基酸代谢相关酶的注释表明，L.amylovorus S1株具有多种参与蛋氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸代谢的酶。

图4 猪小肠L.amylovorus S1的鉴定和全基因组测序

5、与富含AA的底物相比，富含肽的底物增加了淀粉乳杆菌的生长和PBAAs的消失率

为了研究L. amylovorus S1在含Casein- AA（富FAA）和Casein- PEP（富PBAA）为氮源的培养基中的生长，生成了生长曲线（图5A）。L. amylovorus S1在两种基质的生长在6h前均遵循相同的指数阶段，在Casein- AA和Casein- PEP中分别在6小时和12小时达到稳定阶段。12 h时，富PBAA底物中L. amylovorus S1的数量较富FAA底物增加了22.96%（p < 0.001，图5B）。

为了研究L. amylovorus S1对氮源的底物利用情况，在体外培养后检测了PBAAs和FAAs的细菌利用情况（图5C）。Casein- PEP组中PBAAs在12h内的消失量高于FAAs（p<0.001），而Casein- AA组中PBAAs和FAAs的消失量无明显差异（p = 0.719）。这些结果表明，L. amylovorus S1在多肽作用下的生长效果优于游离AAs。

图5 L. amylovorus S1在体外富氨基酸或富肽底物中的生长性状和对肽结合氨基酸的利用

6、富含肽的底物增加了细菌肽的利用率

寡肽ABC转运蛋白结合蛋白（Opt）家族是细菌细胞吸收多肽的关键。Casein-PEP组在培养后6小时和12小时，寡肽ABC转运体optB的基因表达显著上调（图5E）。为了研究可能与OptB结合的AAs，进行了蛋白质配体结合位点预测。OptB的结构采用SPARKS-X预测，模板为7ofwA，z值为22.820（截止值为6.9）。预测结果表明，OptB中含有苏氨酸（T58,T291）、苯丙氨酸（F63,F423）、缬氨酸（V60, V439）、丝氨酸（S443）、甘氨酸（G441）和赖氨酸（K511）的配体结合位点（图5F），其置信得分为0.80，表明这些AAs可能与OptB结合并进行高亲和性转运。

这些结果表明，optB基因表达的上调伴随着肽结合形式的苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸和赖氨酸的利用增加，这些肽结合可以结合optB AA-rich基质。

7、富肽底物进一步提高了细菌对AA的利用

为了研究AA的利用率是否发生了改变，本研究进一步测量了FAAs的0-12h-消失率。与酪蛋白-AA组相比，酪蛋白-PEP组缬氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、精氨酸和赖氨酸的消失率显著升高，天冬氨酸和谷氨酸组间差异不显著（图6A）。AA的利用依赖于它们的转运体和代谢酶。

图6 淀粉乳杆菌S1在体外对游离AAs的利用、转运和代谢

8、富含肽和AA的底物导致了不同的发酵模式

为了表征富AA和富肽底物下的代谢最终产物，研究测量了短链脂肪酸和乳酸。培养24 h后，酪蛋白-PEP的乳酸产量升高（p < 0.001，图7A），而乳酸产量在6 h（p < 0.001）、12 h（p = 0.010）和24 h时，乳酸脱氢酶（ldh）基因表达上调（图7B）。与乳酸含量的增加相对应，酪蛋白-PEP在培养24 h后的pH值较低（p = 0.018，图7C）。

醋酸盐作为微生物发酵产物，在微生物来源的SCFAs中占很高的比例，数据表明，在培养24 h的SCFAs中，醋酸盐是唯一检测到的细菌代谢物。

除了氨基酸，葡萄糖浓度也会影响发酵模式。为了确定葡萄糖是否可能是一个混杂因素，进一步测量了葡萄糖浓度，发现葡萄糖浓度没有明显的差异（图7F），说明乳酸和醋酸盐生产优势的差异可能主要由不同基质中氨基酸和肽的含量所驱动（图7G）。

 图7 在体外培养过程中，富含氨基酸或富含肽的底物的不同代谢模式。

四、总结

综上所述，这些结果表明，PBAAs利用能力的提高有助于淀粉乳杆菌的优势，表明氨基酸利用是影响肠道微生物分布的决定性因素。研究证据支持了一个长期存在的生态学理论，即养分利用是形成微生物分布的一个重要的决定因素。此外，本研究为解释小肠中关键类群的性能提供了一种战略方法，可进一步应用于其他微生物和未来的研究。

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参考文献

Amino acid utilization allows intestinal dominance of Lactobacillus amylovorus. The ISME Journal, 2022.