凌恩生物重磅推出HiFi-meta技术服务,三代宏基因组测序组装方案全新升级!获得完成图水平的MAGs,助力更全面的功能基因挖掘,深耕可移动基因单元-宿主关系,欢迎广大微生态领域研究用户垂询。
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期刊:Gigascience
影响因子:7.658
发表时间:2022年11月
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一、研究背景
养鸡业是我国畜牧业的重要产业,鸡肠道微生物群对宿主健康和生长有着显著的影响,既往的研究已经构建了数万个鸡肠道宏基因组组装基因组(MAG)。然而,由于短读长测序和组装技术的局限性,大多数MAG的质量较低,且包含污染reads。
二、研究方法
选取30只42天龄的岭南黄肉鸡,分别从十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠5个肠室采集150份食糜样本,进行HiFi宏基因组测序。
三、研究结果
1.HiFi reads可以组装出较长的contigs
十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠的HiFi reads如下表所示(表1)。HiFi reads的N50长度为17 kb左右。5个肠段初步组装的contig N50大小均在28kb以上。相比之下,短读长宏基因组的N50大小通常小于10 kb,这表明HiFi reads在contig连续性方面有实质性的改进。此外,覆盖深度与单碱基质量值正相关,表明较高的覆盖深度会提高序列的精度。
表1 HiFi测序数据统计
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图1 contig 组装统计信息
2.组装出数百个完整的微生物基因组(MAGs)
从5个肠段中分别得到了27、40、62、285和334个中等质量的MAGs(图3A)。分别在菌株和种水平组装了461和337个MAGs,其中53%和55%是环状的。环状MAGs checkM评分也更高(图3B,C)。研究发现较高的覆盖深度与checkM完整性评分呈正相关,表明覆盖深度的提高有利于组装出更精准的MAGs。
宏基因组中质粒比宿主基因组更难组装。本研究分别识别出61、67、71、81和78个环状质粒基因组。此外,还鉴定到33、14、14、52和50个环状病毒基因组。
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图2 MGAs情况展示
在原核生物中,rRNA和tRNA基因的鉴定是衡量基因组完整性的重要手段。研究者对461个MAGs中的rRNA和tRNA基因进行注释,发现439个(95%)基因组是“RNA完整”的,同时满足rRNA和tRNA标准。大多数MAGs有1到6个rRNA操纵子(图4A)和35到65个tRNA基因拷贝(图4B)。此外,环状基因组中rRNA操纵子和tRNA基因的数量更多。
3.HiFi组装基因组优于短读长组装的MAGs
本研究发现的461个菌株水平MAGs中有384个(83%)是新基因组,包括209个(45%)环状基因组和175个(38%)非环状MAGs(图5A)。与已报道的种水平MAGs相比,本研究的337个种水平基因组中有89个(26%)是新基因组,包括50个(15%)环状基因组和39个(12%)非环状MAGs(图5B)。由于样本量的限制,目前HiFi组装的MAGs比短读长组装的少,但质量明显优于短读长MAGs,基因集的完整性也更高,通过与已发表的两个短读长基因集比较,发现HiFi基因集中有大量的新基因。如图5所示,HiFi组装的微生物基因组平均contig数更少、基因组更长、完整度更高、污染程度更低。
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图3 HiFi组装的微生物基因组与短reads组装的MAGs的比较
4.不同肠段的HiFi-MAGs组成存在差异
使用GTDB-Tk将HiFi组装的种水平MAGs与GTDB数据库中的47894个物种簇进行比对、分类学注释。其中,只有1个MAGs被注释为古菌,其余336个MAGs均属于细菌。优势门为厚壁菌门,其次为拟杆菌门和放线菌门,这3个门总共覆盖了317个(94%)MAGs。
前肠由十二指肠、空肠和回肠组成,主要负责饲料的消化和营养物质的吸收。后肠包含盲肠和结肠,它们的功能是发酵、解毒和回收残余的水和盐。前肠和后肠之间的微生物组成有明显的差异。前肠高度富集的5个属:Ligilactobacillus、limmosilactobacillus、乳酸菌、魏斯氏菌和肠球菌。相比之下,后肠的物种多样性更高。因此,对所有肠段进行分析有利于全面了解肠道微生物。
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图4 HiFi组装的微生物基因组的系统发育
5.新的基因组表征和新的种属发现
通过GTDB-Tk注释,发现部分MAGs在科、属和种分类学水平上无法进行分类,这表明它们可能是一些新的菌,可能在工业或医学领域有潜在的价值。近年来,乳酸菌及其近亲Ligilactobacillus和Limmosilactobacillus被广泛用作益生菌补充剂,本次组装的2个Ligilactobacillus基因组和1个Limmosilactobacillus基因组还没有注释到种水平,表明这3个基因组可能为益生菌的发展提供了新的基因资源。使用核糖体数据库(RDP)进一步对这些低分类学级别的基因组进行分类,发现这些基因组中有9个和49个可能分别对应于新的属和种,这拓宽了人们对微生物世界的认识。此外,这些新发现的属中约有1 / 3,新发现的种中约有一半没有在短读长MAG数据中发现,这表明它们仅来自HiFi宏基因组数据,进一步显示了HiFi测序在宏基因组研究中的优势。
四、研究结论
HiFi 测序显著提高了宏基因组组装质量,也恢复了以前基于短读长的宏基因组研究中遗漏的大部分新基因组,本研究获得的新基因组和物种将促进肠道微生物组和宿主-微生物群相互作用研究,从而促进家禽资源的可持续发展。
参考文献
Improved microbial genomes and gene catalog of the chicken gut from metagenomic sequencing of high-fidelity long reads.Gigascience.2022