鱼类eDNA引物怎么选？

环境DNA（eDNA）源自生物体脱落到水生或陆地环境中的细胞物质，可以通过宏条形码技术进行监测。eDNA宏条形码技术在鱼类多样性调查研究中的优势明显，相比于传统的捕捞、拖网监测技术，eDNA宏条形码技术灵敏度更高，能够检出更多的海洋脊索物种，并且具有高时效性，在水生生态系统物种监测中的意义不可低估。eDNA应用中遇到最多的问题就是：引物如何选择？扩增效果如何？今天小编就不同的研究对象给大家推荐最佳引物，一起来看吧！

特异性引物

一

• 研究对象：海水鱼类

• 引物推荐：

MiFish-E-F：GTTGGTAAATCTCGTGCCAGC

MiFish-E-R：CATAGTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG

• 案例分享

本文旨在对使用代谢条形码技术进行鱼类eDNA监测以评估鱼类生物多样性的研究进行全面的文献回顾。系统地提供了可用于从鱼类eDNA中扩增条形码序列的通用引物，并讨论了参考条形码数据库、相关生物信息学分析以及已开发的管道。总结了通用引物及其相关参考数据库的性能，并推荐使用针对多个基因标记（例如12S、16S、Cytb、COI）设计的多个引物对，同时利用本地和公共数据库相结合，以提高鱼类eDNA分析的灵敏度和可靠性。

• 研究对象：淡水鱼类

• 推荐引物：

Tele02_F：AAACTCGTGCCAGCCACC

Tele02_R：GGGTATCTAATCCCAGTTTG

• 案例分享

本研究利用从中国北京109个水体采集的环境DNA（eDNA）评估了包括水生和陆生脊椎动物在内的所有物种多样性。使用Tele02进行eDNA测序，检测到126种脊椎动物，其中包括73种鱼类、39种鸟类、11种哺乳动物和3种爬行动物，它们分属于91个属、46个科和22个目。不同物种在eDNA中被检测到的概率因其生活方式而异，例如与水生和树栖群体相比，鱼类具有更高可检测性，而与森林鸟类相比，则是水鸟具有更高可检测性。此外，在静水位点相对于流水位点上，所有脊椎动物以及鸟类（p<0.001）在eDNA检测方面表现出较高概率。此外，在鱼类中发现了静态水体大小与其多样性之间呈正相关关系，但其他群体则没有这样的相关性。研究结果表明，在异质化城市景观中，基于eDNA技术能够有效调查广泛空间范围内各类脊椎动物群落。

三

• 研究对象：淡水鱼类

• 推荐引物

Ac12s_F：ACTGGGATTAGATACCCCACTATG

Ac12s_R：GAGAGTGACGGGCGGTGT

• 案例分享

本研究以北京为研究区域，对109个静水和动水水体开展eDNA的鱼类多样性调查，共鉴定到75种鱼类（52个本地原生鱼种和23个外来鱼种）。同时对水体进行水质理化指标测定，分析环境指标对鱼类多样性分布的影响。发现北京地区具有较高的鱼类多样性，但非本地鱼种占全部鱼类的30%。鱼类群落同质化较为明显，但不同水体类型间鱼类群落组成也存在一定差异。

通用引物

一

• 研究对象：鱼类（包括海水和淡水）

• 推荐引物

V12S-U-F：GTGCCAGCNRCCGCGGTYANAC

V12S-U-R：ATAGTRGGGTATCTAATCCYAGT

• 案例分享

环境DNA（eDNA）测序是监测自然生态系统生物多样性的强有力工具。eDNA测序的准确性在很大程度上取决于PCR引物对扩增目标序列的选择。针对脊椎动物，现有引物主要是为特定群体设计的，迄今尚未开发出适用于所有脊椎动物的“通用”引物。因此，在本研究设计了三个新的通用引物集（V12S-U、V16S-U和VCOI-U），分别针对线粒体12S、16S和COI基因，并且这些引物适用于所有脊椎动物群体，扩增长度为200-250 bp，方便使用短读测序平台进行检测。通过在模拟数据进行评估，发现新设计的引物集具有超过90% 的种类检测成功率，并展示出优于已发表引物集性能更好。此外还利用水生环境中采集到的eDNA样本测试了这些新设计的引物在BLAST相似度≥0.95条件下共检测到895个脊椎动物OTU，包括182个不同种类、195个属以及94个科。该研究结果提示多重标记比单一标记更适合实现脊椎动物等大型生物群落的种类检测。

二

• 研究对象：真核生物

• 推荐引物：

MlCOIintF：GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC

JgHCO2198：TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA

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本研究采用了两个分子标记：线粒体细胞色素c氧化酶（COI）片段以及核小亚基核糖体RNA（18S）的V7区域，研究了西班牙两个国家公园沿岸八个浅水海洋群落。发现这些海洋群落拥有大量尚未描述的真核生物多样性。在序列参考数据库中仍存在显著缺口，目前阻碍对检测序列进行完整分类学归类。数据集中，85%的18S OTUs和64% 的COI OTUs 可以被现有数据库注释到。然而，未注释的OTUs主要是稀有种，并且其序列数较少；已注释的OTUs则占总序列读数90%以上。注释到线虫、轮虫、底栖介形虫、鱼类以及甲壳动物。eDNA作为一种可靠、快速、客观且经济有效方法可用于全面描述以宏观海藻和群居或模块化固着无脊椎动物为主导的海洋底栖社区多样性情况。

三

• 研究对象：脊椎动物（鱼类、鸟类和两栖动物

• 推荐引物：

12SV05 forward：TTAGATACCCCACTATGC

12SV05 reverse ：TAGAACAGGCTCCTCTAG

• 案例分享

目前生物多样性和气候危机凸显了监测陆地生态系统的必要性，需要高效工具。本研究提供了一种新型方法——使用空气eDNA分析来检测自然环境中陆地脊椎动物群落。在丹麦森林采集43个空气环境DNA样本进行分析，发现64种鸟类、哺乳动物、鱼类和两栖动物类群，其中57种“野生”类群代表该地区约四分之一的210种陆地脊椎动物。此外，研究还提供了关于空中环境DNA的空间移动和时间模式证据以及天气条件对脊椎动物检测影响方面的信息。这项研究证明了空气eDNA在高分辨率生物监测方面应用广泛，并阐明其在当前生物多样性危机下指导全球自然管理和保护工作的巨大潜力。

通过上述介绍，相信大家已经明白了鱼类eDNA研究中引物的特征以及偏好性，小编也将文中的引物做了汇总，表格如下：

引物分类	引物名称	引物序列	目标对象
特异性 引物	MiFish-E-F	GTTGGTAAATCTCGTGCCAGC	海水鱼类
	MiFish-E-R	CATAGTGGGGTATCTAATCCTAGTTTG
	Tele02_F	AAACTCGTGCCAGCCACC	淡水鱼类
	Tele02_R	GGGTATCTAATCCCAGTTTG
	Ac12s_F	ACTGGGATTAGATACCCCACTATG	淡水鱼类
	Ac12s_R	GAGAGTGACGGGCGGTGT
通用 引物	V12S-U-F	GTGCCAGCNRCCGCGGTYANAC	鱼类
	V12S-U-R	ATAGTRGGGTATCTAATCCYAGT
	MlCOIintF	GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC	真核生物
	JgHCO2198	TAIACYTCIGGRTGICCRAARAAYCA
	12SV05 forward	TTAGATACCCCACTATGC	脊椎动物
	12SV05 reverse	TAGAACAGGCTCCTCTAG

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针对不同类型的动物

eDNA引物该如何选择？！

参考文献

[1]Methodology for fish biodiversity monitoring with environmental DNA metabarcoding: The primers, databases and bioinformatic pipelines.Water Biology and Security,2022.

[2]Urban landscape-level biodiversity assessments of aquatic and terrestrial vertebrates by environmental DNA metabarcoding.Journal of Environmental Management,2023.

[3]Environmental DNA captures native and non-native fish community variations across the lentic and lotic systems of a megacity.Science Advances,2022.

[4]VertU: universal multilocus primer sets for eDNA metabarcoding of vertebrate diversity, evaluated by both artificial and natural cases.Frontiers in Ecology and Evolution,2023.

[5]DNA metabarcoding of littoral hardbottom communities: high diversity and database gaps revealed by two molecular markers.Peer J,2018.

[6]Airborne environmental DNA captures terrestrial vertebrate diversity in nature.Molecular Ecology Resources,2024.