蛋白纯化表达实验技术介绍

蛋白纯化表达实验技术介绍

一、技术概述

蛋白纯化表达技术是通过基因工程手段将目标蛋白在宿主细胞（如大肠杆菌）中高效表达，并通过亲和层析（如Ni-NTA纯化）结合物理化学方法（超声破碎、离心分离）获得高纯度蛋白的核心技术。

二、实验目的

本实验基于Rosetta(DE3)感受态细胞与IPTG诱导表达系统，结合SDS-PAGE电泳与考马斯亮蓝染色进行表达验证，最终通过Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白，为功能研究、结构解析及药物开发提供高质量蛋白样品。  

三、实验流程
1.质粒转化

1. 将感受态细胞置于冰上融化;
2. 取10ng质粒加入至100 µL Rosetta(DE3)感受态细胞中。轻轻旋转混匀，冰浴30 min。
3. 将离心管置于 42℃水浴中 80 秒，然后快速转移到冰浴中放置 3 分钟，注意不要摇动离心管;
4. 加入300 µL无菌无抗生素 LB培养基，混匀， 37 °C、200 rpm振荡培养1 h;
5. 于超净工作台中，将菌液均匀涂布于含抗生素（100 μg/mL）的LB平板上，室温下放置，至液体吸收。
6. 倒置平板，转移入37 °C生化培养箱过夜培养。

2.扩大培养

1. 转移阳性单菌落到40ml LB液体培养基扩培（提前加入对应抗生素）；
2. 等培养基比较混浊时，取1ml菌液标记为诱导前，加入40ul  25mg/ml 的IPTG诱导剂进行诱导3h；

3.超声破碎

1. 诱导好的菌，1000g离心收集细胞沉淀，加入2ml 细胞裂解液,20ul蛋白酶抑制剂，20ul PMSF;超声条件：功率：30%、超3s、停5s 超声时间25min;
2. 12000g离心；转移上清至新的离心管中；

4.表达形式鉴定：

a. 配制12%SDS-PAGE胶

b. 取诱导前的样本100ul与超声后的样本100ul 加入25ul 5×loading进行沸水浴10min;然后100V电泳；

c. 超声后的样本12000g离心10min;取上清和沉淀分别进行电泳；

5.马斯亮蓝染色

电泳后的胶进行考马斯亮蓝染色；染色15min;终止染色；弃染液后，加入自来水，用微波炉煮样，期间多次换水；将胶煮透明。

6.蛋白质纯化（详细操作步骤参考 生工蛋白纯化试剂盒/Ni-NTA 6FF His标签蛋白纯化试剂盒）

1. 取超声破碎后的菌液，加入适量的Binding buffer,混匀后直接过柱。
2. 用washing buffer进行洗涤，洗涤5次；
3. 加入洗脱液进行洗脱。

7.蛋白浓度测定

用Nano-800进行蛋白浓度测定

四、技术优势

✅  灵活诱导：IPTG浓度与温度可调，适配可溶性表达或包涵体优化

✅  高纯度蛋白：Ni-NTA纯化后纯度>90%，满足结构生物学需求

✅  快速验证：SDS-PAGE结合考马斯亮蓝染色，1天内完成表达分析

• 适用范围

1️⃣ 重组蛋白生产：原核/真核表达系统优化

2️⃣ 抗体开发：抗原制备与纯化

3️⃣ 酶学研究：活性蛋白的获取与功能验证

• 代表性实验结果