QPCR绝对定量实验（探针法）介绍

QPCR绝对定量实验（探针法）介绍

• 技术概述

实时荧光定量PCR（qPCR）探针法是一种高灵敏度、高特异性的核酸定量技术。本实验采用TaqMan探针法，通过探针上的荧光报告基团与淬灭基团分离释放荧光信号，实时监测PCR扩增进程，结合标准曲线对目标基因进行绝对定量，精确计算样本中核酸的拷贝数或浓度。该方法适用于低丰度靶标检测及严格定量需求的研究，如病原体载量分析、转基因成分定量等。

二、实验目的

通过构建标准曲线，利用探针法qPCR技术对目标基因（如病毒基因组、转基因序列、特定基因表达产物等）进行绝对定量，提供拷贝数或浓度的精准数据，为临床诊断、基因表达分析、食品安全检测及药物研发提供关键依据。  

三、实验流程
1、DNA抽提

取约10mg样品至冷冻研钵中，加入液氮研磨至粉末状，转移至1.5mL离心管中，加200 uL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。然后，严格按照“TIANamp Bacteria DNA Kit”说明书步骤进行提取，详见说明书附件。

最终洗脱体积均为50uL。

2、定量PCR检测

1）将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。

2）冰上配制下表中的反应液

成分	加入量	终浓度
Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2X）	5μL	1×
Forward Primer (10μM)	0.2μL	0.2 μM
Reverse Primer (10μM)	0.2μL	0.2 μM
Probe(10μM)	0.4μL	0.4 μM
ROX Reference Dye Ⅱ（50X）	0.1μL	0.5×
DNA 模板	4.1 μL

3）将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。

4）采用三步法程序进行反应：

循环数	步骤	温度	时间
1	预变性	95℃	20s
40	变性	95℃	3s
	扩增	60℃	30s

四、技术优势

✅  高特异性：探针与靶序列特异性结合，避免非特异性扩增干扰

✅  高灵敏度：可检测低至1拷贝/μL的靶标，适用于痕量样本

✅  绝对定量：基于标准曲线提供精确拷贝数，数据可比性强

✅  应用广泛：适用于血液、组织、细胞等多种样本类型

• 适用范围

1️⃣ 病原体载量检测（病毒、细菌、真菌）

2️⃣ 转基因生物（GMO）成分定量分析

3️⃣ 基因表达绝对定量（mRNA/miRNA）

4️⃣ 药物疗效评估（靶基因表达动态监测）

• 代表性实验