RNA-Seq数据分析流程

RNA-seq 数据分析流程

相关软件安装

可以安装 conda,在后续其他软件安装时非常好用。可自行百度进行安装
可根据文献调研，转录组数据分析所需软件列表：
质控
fastqc , multiqc, trimmomatic, cutadapt ,trim-galore
比对
star, hisat2, bowtie2, tophat, bwa, subread
计数
htseq, bedtools, deeptools, salmon

在安装之前可以先 search一下安装包是否存在

# conda search packagename
conda install -y sra-tools
conda install -y trimmomatic
conda install -y cutadapt multiqc 
conda install -y trim-galore
conda install -y star hisat2 bowtie2
conda install -y subread tophat htseq bedtools deeptools
conda install -y salmon

软件安装时，可以使用conda一步安装，也可以自行百度，下载源码，解压后添加环境变量，使用。
但是在使用sra-tookit时出现了问题，因为已经提前用conda安装好了sra-tools,后面我在网页下载解压了sratoolkit,并且在环境变量中添加好了，导致两个软件版本不合，使用prefetch下载网页数据时总是报错。所以需要卸载其中一种，保持版本一致。
自行安装sratoolkit可参考：sratoolkit安装

下载数据

进入网页，得到SRR_Acc_list.txt

SRR957677
SRR957678
SRR957679
SRR957680

批量下载

wkd=/home/meiling/baiduyundisk/RNA-seq #设置工作目录
cat SRR_Acc_List.txt | while read id; do (nohup prefetch  ${id} &);done
#ps -ef | grep prefetch | awk '{print $2}' | while read id; do kill ${id}; done #在内地下载速度很慢，所以我杀掉这些下载进程

当显示所有下载都sucessful时，可以进行下一步

下载完成之后，文件会自动保存在目录：~/ncbi/public/sra/

mv ~/ncbi/public/sra/*.sra $wkd/rawdata

sra转fastq格式

使用fastq-dump

wkd=/home/meiling/baiduyundisk/RNA-seq #设置工作目录

for i in $wkd/rawdata/*sra
do
        echo $i
        fastq-dump --split-3 --skip-technical --clip --gzip $i  ## 批量转换
done

原始数据如果是双端测序结果，fastq-dump配合–split-3参数，一个样本被拆分成两个fastq文件，如果是单端测序，就只生成一个文件

数据质控

fastqc生成质控报告，multiqc将各个样本的质控报告整合为一个。

wkd=/home/meiling/baiduyundisk/RNA-seq #设置工作目录

ls $wkd/rawdata/*gz | xargs fastqc -t 2
multiqc ./ 

得到结果如下：

├── [4.0K]  multiqc_data
│   ├── [2.1M]  multiqc_data.json
│   ├── [6.8K]  multiqc_fastqc.txt
│   ├── [2.2K]  multiqc_general_stats.txt
│   ├── [ 16K]  multiqc.log
│   └── [3.4K]  multiqc_sources.txt
├── [1.5M]  multiqc_report.html
├── [236K]  SRR1039508_1_fastqc.html
├── [279K]  SRR1039508_1_fastqc.zip
├── [238K]  SRR1039508_2_fastqc.html
├── [286K]  SRR1039508_2_fastqc.zip

每个id_fastqc.html都是一个质量报告，multiqc_report.html是所有样本的整合报告

数据质控，过滤低质量reads，去接头

如果双端测序，运行一下代码，得到两列数据，config文件

mkdir $wkd/clean 
cd $wkd/clean 
ls /home/jmzeng/project/airway/raw/*_1.fastq.gz >1
ls /home/jmzeng/project/airway/raw/*_2.fastq.gz >2
paste 1 2  > config

并打开qc.sh,写入一下内容：

bin_trim_galore=trim_galore
dir='/home/jmzeng/project/airway/clean'
cat $1 |while read id
do
        arr=(