成功案例|打鼾伤血管的真相找到了！这种肠道菌超标可致动脉斑块增加30%

01 研究背景

阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）是一种常见的睡眠障碍，表现为睡眠中反复发生上呼吸道塌陷，导致间歇性低氧（IH）和高碳酸血症（HC）（合称IHC）。全球约10亿人受OSA影响，肥胖人群患病率高达30-70%，并且OSA是动脉粥样硬化的独立风险因素，与心肌梗死、中风等密切相关。肠道菌群及其代谢物在动脉粥硬化中的作用已经被初步探索，但OSA通过菌群促进动脉粥硬化的机制尚不明确。本研究通过多组学方法，探究高脂高胆固醇饮食（HFHC）和IHC如何通过肠道菌群及其代谢物协同促进动脉粥样硬化，同时研究了肠道微生物群与OSA诱导的动脉粥样硬化之间的因果关系。

02 技术路线

03 研究内容

1.IHC加重了HFHC饮食下动脉粥样硬化斑块的形成

为了研究高脂肪高胆固醇（HFHC）饮食和间歇性缺氧 / 高碳酸血症（IHC）对动脉粥样硬化病变发展的影响，研究人员给 SPF（无特定病原体）Apoe⁻/⁻小鼠喂食 HFHC 饮食或普通饲料（RC）10 周。同时，让这些小鼠暴露在室内空气（Air）或间歇性缺氧 / 高碳酸血症（IHC）环境中，以研究阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）潜在的致动脉粥样硬化作用。接受 HFHC 饮食的小鼠比在室内空气中喂食 RC 的小鼠出现了明显更多的动脉粥样硬化病变（图 1）。结果表明间歇性缺氧 / 高碳酸血症（IHC）与 HFHC 协同作用，影响动脉粥样硬化的发展。为了评估饮食和环境暴露对病变发展的影响，研究人员测量了小鼠的体重和食物摄入量。HFHC 饮食导致小鼠体重增加更多；而 IHC 暴露虽然使小鼠体重增加减少，但却加剧了动脉粥样硬化病变的形成。此外，小鼠对不同饮食的摄入量存在差异，且 IHC 应激会抑制小鼠的食物摄入。

图1 无特定病原体（SPF）的载脂蛋白 E 基因敲除（Apoe⁻/⁻）小鼠在接受为期 10 周的高脂肪高胆固醇饮食且伴有或不伴有间歇性缺氧 / 高碳酸血症情况下的动脉粥样硬化病变情况

2.高脂肪高胆固醇饮食（HFHC）和无间歇性缺氧 / 高碳酸血症（IHC）都会改变肠道微生物群的组成

为了解HFHC和IHC对肠道微生物群组成的变化，在研究期间（10周）每3-4天收集所有小鼠的连续粪便样本，采用16S V4扩增子测序分析。β 多样性（图 2A、B）发现，在初始时间点，当所有动物都食用常规饲料（RC）时，各组之间没有显著差异，但随着时间的推移，差异逐渐累积。此外，对 α 多样性指标的检查也揭示了饮食对微生物组组成的强烈影响，在这些差异中，毛螺菌科（Muribaculaceae）和阿克曼菌科（Akkermansiaceae）是两个关键的重叠细菌家族，它们呈现出相反的富集趋势（图2C、D）。基于之前的研究成果 ，以及利用稳健主成分分析（RPCA）排名（图 2A）、时间张量分解（TEMPTED）排名（图 2B）和 ANCOM - BC 判别特征（图 2C、D）从本数据集获得的差异丰度结果，作者研究了一个相关的自然对数比，用于比较属于毛螺菌科和阿克曼菌科的扩增子序列变异（ASV）的读数（图 2E）。使用线性混合效应模型分析时，该对数比显示随着时间推移，所有三组之间存在显著差异。高脂肪高胆固醇饮食并暴露于 IHC 条件下的小鼠，尤其在实验结束时，是最有可能拥有比毛螺菌科更多阿克曼菌科的一组（图 2F）。

图2 无特定病原体（SPF）的载脂蛋白 E 基因敲除（Apoe −1−）小鼠在接受为期 10 周的高脂肪高胆固醇饮食（HFHC）且有无间歇性缺氧 / 高碳酸血症（IHC）处理情况下的微生物组分析

3.高脂肪高胆固醇饮食（HFHC）和间歇性缺氧 / 高碳酸血症（IHC）深刻影响粪便代谢谱

非靶向代谢组学分析显示，通过主成分分析（PCA）发现，饮食和空气暴露均可使粪便代谢物明显区分开来（图 3A）。差异结果显示，HFHC 饮食使 200 多种已注释或推测注释的胆汁酸增加，包括胆酸（CA）、脱氧胆酸（DCA）、石胆酸、牛磺胆酸等，以及最近描述的微生物胆汁酸 Ile/Leu - CA等。此外，HFHC 饮食还使最近描述的长链 N - 酰基酰胺增加，如 Leu - C16:0、Lys - C16:0、Phe - C16:0等，以及几种磷脂酰胆碱，包括 PC（16:0/0:0）、PC (16:1/0:0)、PC（16:0/20:5）等，还有鞘氨醇（C17 和 C18）。另一方面，HFHC 饮食似乎降低了 50 多种未注释的单羟基、二羟基、三羟基、四羟基和五羟基胆汁酸的丰度，以及几种短链 N - 酰基酰胺，100多种二肽和三肽。在第一个时间点之后，当所有动物都在接受 RC 饮食时，这些提取特征的对数比能够区分接受或未接受 HFHC 饮食的动物（图 3B）。

IHC导致100多种已注释和推测的胆汁酸增加，包括牛磺石胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺胆酸等物质。IHC 还降低了几种胆汁酸的丰度。空气组相关特征与HFHC 、IHC组相关特征的对数比，显著区分了所关注的三组（图 3C）。分子特征子网络以展示一些导致组间差异的分子，如胆汁酸、磷脂酰胆碱和 N - 酰基酰胺（图 3D）。由于HFHC 促进了动脉粥样硬化的形成，而 IHC 进一步加速了这一过程，因此研究人员识别出了441个具有一致或相反变化模式的特征子集，因为这些分子可能在生物学上与相关的动脉粥样硬化发展高度相关。研究人员还通过单变量分析对具有代表性的感兴趣分子进行了研究，以突出组间差异（图 3E）。

图3 无特定病原体（SPF）的载脂蛋白 E 基因敲除（Apoe−1−）小鼠在接受为期 10 周的高脂肪高胆固醇饮食（HFHC）且有无间歇性缺氧 / 高碳酸血症（IHC）处理情况下的代谢组学分析

4.Akkermansiaceae与Muribaculaceae的比例影响代谢物谱

利用前文所讨论的微生物组和代谢组的对数比，绘制了散点图来观察样本聚类情况（图 4A）。当对数比偏向与常规饮食-空气条件相关的代谢物，且更倾向于Muribaculaceae的扩增子序列变异（ASV）时，多数样本为常规饮食-空气组样本。相反，当对数比偏向与高脂肪高胆固醇饮食（HFHC）-间歇性缺氧 / 高碳酸血症（IHC）条件相关的代谢物，且更倾向于Akkermansiaceae的 ASV 时，多数样本为 HFHC - IHC 组样本。虽然观察到所有三组都有明显的聚类情况，但饮食似乎有着较大影响。此外，还可以看到一种显著且较强的线性关系（图 4B）。总之，这些结果表明，存在一种明显的微生物组和代谢物特征，该特征似乎与对饮食和暴露类型的响应相关。

图4 微生物组和代谢组对数比值的比较

5.微生物群缺失可减轻高脂肪高胆固醇饮食（HFHC）和间歇性缺氧 / 高碳酸血症（IHC）在主动脉中诱发的动脉粥样硬化，但对肺动脉中的动脉粥样硬化并无此作用

为了探究肠道微生物群是否在高脂肪高胆固醇饮食（HFHC）和间歇性缺氧 / 高碳酸血症（IHC）诱导的动脉粥样硬化中起作用，对无菌（GF）的小鼠像无特定病原体（SPF）动物一样，在空气环境或间歇性缺氧 / 高碳酸血症（IHC）环境下，喂食相同的高脂肪高胆固醇饮食，持续10周。结果发现在高脂肪高胆固醇饮食（HFHC）诱导下，无菌小鼠主动脉（主要是不包括主动脉弓的主动脉主干部分）中的病变显著少于无特定病原体小鼠（图 5A、B）。当暴露于间歇性缺氧 / 高碳酸血症（IHC）环境时，无菌Apoe−/−小鼠相较于无特定病原体对照组，仅在主动脉主干部分出现统计学意义上更少的病变，在其他被检测的血管区域则未出现这种情况（图 5C、D）。这些数据表明，微生物定殖对不同血管床中动脉粥样硬化的调节作用存在差异。

如图 1 所示，在高脂肪高胆固醇饮食（HFHC）存在的情况下，间歇性缺氧 / 高碳酸血症（IHC）促进了无特定病原体（SPF）的载脂蛋白 E 基因敲除（Apoe −1−）小鼠的主动脉、主动脉弓以及肺动脉中动脉粥样硬化的形成。然而，对于喂食高脂肪高胆固醇饮食的无菌（GF）Apoe −1−小鼠，IHC 对动脉粥样硬化的影响仅在肺动脉中被检测到，在主动脉中则未检测到（图6）。这些数据表明：（1）微生物群是 IHC 诱导主动脉发生动脉粥样硬化所必需的；（2）在肺动脉中，IHC 诱导动脉粥样硬化存在不依赖微生物群的机制。

图5 无菌（GF）和无特定病原体（SPF）的载脂蛋白 E 基因敲除（Apoe−1−）小鼠在经过 10 周高脂肪高胆固醇饮食（HFHC）或间歇性缺氧 / 高碳酸血症（IHC）暴露后的动脉粥样硬化病变情况

图6 无菌（GF）载脂蛋白 E 基因敲除（Apoe−1−）小鼠经过 10 周间歇性缺氧 / 高碳酸血症（IHC）及空气处理后的动脉粥样硬化病变情况

04 研究结论

综上所述，该研究证明了间歇性缺氧 / 高碳酸血症（IHC）和高脂肪高胆固醇饮食（HFHC）协同促进动脉粥样硬化，且这一过程需要肠道微生物群的存在。阿克曼菌科和毛螺菌科细菌家族，以及微生物代谢产物胆汁酸，似乎是阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）诱导的动脉粥样硬化的重要调节因子。这些研究成果有助于我们更好地理解饮食、微生物群与 IHC/OSA 诱导的动脉粥样硬化之间的机制联系，并为未来预防和治疗 OSA 诱导的动脉粥样硬化的治疗方法提供了依据。例如，可通过使用益生元、益生菌或合生元纠正肠道菌群失调，或使用法尼醇 X 受体（FXR）/ 武田 G 蛋白偶联受体 5（TGR5）激动剂或拮抗剂调节胆汁酸信号传导，并结合饮食调整来进行干预。