还在单细胞测序？单核更出色

单细胞RNA-seq（single cell RNA-seq, scRNA-seq）是目前用于细胞类型、细胞状态研究的核心工具，很多实验室也同时围绕scRNA-seq技术建立了多种计算方法并且优化了建库方法，不同方法在如何鉴别分子的细胞来源和文库建立方面有所区别。scRNA-seq技术不断革新、升级的同时，随之产生的高分辨、高通量数据也助力发表了多项研究成果，以Human Cell Atlas (HCA)为代表的大型单细胞综合数据库也被建立，致力于在单细胞水平上绘制所有人类细胞转录组图谱，推动发展疾病的诊断、检测和治疗。

                      图1.Human Cell Atlas（https://www.humancellatlas.org/）

虽然scRNA-seq给生物研究带来了巨大的影响，但是该技术的实际应用时，仍然面临着巨大的挑战和困境。

1）单细胞悬液的制备是单细胞技术的重要环节，scRNA-seq非常依赖单细胞悬液的质量，常用的10x Genomics平台对于单细胞悬液的要求为细胞起始量大于1×10^5个，活细胞数目在85%以上，无细胞团，无碎片，因此scRNA-seq技术仅适用于新鲜组织样本，但是大量的珍贵样本都是以低温冻存的状态进行保存的，所以这类样本不适用于scRNA-seq；

2）不同的组织、样品类型的适用性不同，在单细胞悬液的制备时需要对样品解离获取单细胞状态，可是不同类型细胞的解离效率存在差异，不同组织类型的解离条件需要多次优化，像成纤维细胞、内皮细胞等多迁入细胞外基质和基底膜中，很难分离，一些敏感细胞在物理外力的处理下会发生破碎，可见不同的组织、样品类型的适用性不同；

3）部份样本类型，如心脏、肌肉、脂肪组织（含有直径比较大的心肌细胞、骨骼肌细胞、成熟脂肪细胞等），这些细胞体积大，商业化的单细胞平台对细胞大小有严格的限制，建议捕获的细胞大小不超过40um，因此30-40um的分子筛会过滤掉感兴趣的大体积细胞，有效信息会大大减少；

4）细胞本身是很脆弱的，解离过程中有可能导致细胞死亡，酶解时间，酶浓度，是否使用宽口枪头，离心力等对细胞状态均有较大影响，37度下借助物理外力的解离和酶消化过程也会给细胞状态造成很大的影响，改变细胞的生物学状态，从而在数据中引入实验造成的偏差（bias）。

酶的类型、酶解时间、酶浓度、机械损伤、离心条件、环境温度、缓冲液等均可影响单细胞悬液的制备。

单细胞核测序（single nucleus RNA-seq, snRNA-seq）对单个核进行分离测序，这种建库策略用单个细胞核代替单个细胞来表示细胞个体的基因表达水平，稳定性高且信息更加全面，细胞核可以从冰冻或者轻度固定的组织中进行提取，单核技术的这一特征有效的避免了细胞悬液制备这一过程对细胞状态的影响，很好的解决了scRNA-seq仅适用于新鲜样本的问题，本期公众号结合相关文献深度比较scRNA-seq和snRNA-seq测序技术的实际应用的优缺点