VCF文件格式

VCF4.3官方文档

Variant Call Format，可以用来表示单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失（InDel，也就是短片段的插入与缺失）、结构变异(SV: Structural Variant，也就是大片段的插入与缺失) 、拷贝数量变异（CNV：Copy Number Variant）【CNV：比如一个基因在染色体的一条染色单体上的数目为1，但是在染色体复制过程中，复制结束后该基因在染色单体数目由1变成了2或者n。尤其在人类基因组中存在大量大于1 kb但小于3 Mb的DNA片段多态。它发生的频率远远高于染色体结构变异，并且整个基因组中覆盖的核苷酸总数大大超过SNP的总数】

基因组上的变异主要有单个碱基的变异（转换、颠换、插入、缺失）以及染色体水平的变异（插入、缺失、易位、倒位）。这些表现在基因组检测上就是：SNP、InDel、SV、Corpangene（插入缺失发生在基因水平）、CNV（发生在串联重复区的插入与缺失）

自发突变/诱发突变。DNA复制过程中由于DNA聚合酶产生错误、DNA物理损伤、转座等，但这些错误和损伤大多会被自身的修复系统修复。

• 碱基能够以互变异构体的不同形式存在【A-T配对变为GC的过程】
  
• InDel：碱基有时从核苷酸移去，留下一个叫做脱嘌呤或者脱嘧啶的缺口，进行下一轮复制时不能够正常配对。胞嘧啶自然脱氨基形成尿嘧啶，因为尿嘧啶并非DNA的碱基所以被DNA自身的修复系统识别并清除，留下一个空位
• 转座子：随机插入到基因组，就相当于基因组上一个位点被复制/剪切后粘贴。当有多个这种序列结构时，他们之间就是同源的，因此就会导致同源重组【同源重组：非姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合，进而引起缺失、重复、倒位等】

1、以##开头的头文件信息

##fileformat=VCFv4.2
##FILTER=<ID=LowQual,Description=“Low quality”>
##FORMAT=<ID=AD,Number=.,Type=Integer,Description=“Allelic depths for the ref and alt alleles in the order listed”>
##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description=“Approximate read depth (reads with MQ=255 or with bad mates are filtered)”>
##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description=“Genotype Quality”>
##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description=“Genotype”>
##FORMAT=<ID=PL,Number=G,Type=Integer,Description=“Normalized, Phred-scaled likelihoods for genotypes as defined in the VCF specification”>
##GATKCommandLine.HaplotypeCaller=<ID=HaplotypeCaller,Version=3.5-0-g36282e4,Date="Tue Apr 03 19:35:05 CST 2018",Epoch=1522755305379,CommandLineOptions="analysis_type=HaplotypeCaller input_file=...>
##GATKCommandLine.SelectVariants=<ID=SelectVariants,Version=3.5-0-g36282e4,Date=“Wed Jun 06 09:33:03 CST 2018”,Epoch=1528248783862,CommandLineOptions="analysis_type=SelectVariants input_file=[] …>
##INFO=<ID=AC,Number=A,Type=Integer,Description="Allele count in genotypes, for each ALT allele, in the same order as listed">
##INFO=<ID=AF,Number=A,Type=Float,Description=“Allele Frequency, for each ALT allele, in the same order as listed”>
##INFO=<ID=AN,Number=1,Type=Integer,Description=“Total number of alleles in called genotypes”>
…
##contig=<ID=chrUn_gl000248,length=39786,assembly=hg19>
##contig=<ID=chrUn_gl000249,length=38502,assembly=hg19>
##reference=file:///opt/NfsDir/PublicDir/reference/ucsc.hg19.fasta
##source=SelectVariants
#CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT son

头文件信息主要包括vcf文件版本、FORMAT、INFO、参考基因组以及执行程序等信息。

2 表头各列含义详解

1. CHROM(chromosome):染色体

2. POS变异位点在参考基因组中的位置
   变异位点相对于参考基因组所在的最左端位置 （属于1-坐标系统：从1开始计数）【如果是InDel的情况，那么这个数值对应InDel的第一个碱基位置】
   1-based coordinate system ：序列的第一个碱基设为数字1，如SAM,VCF,GFF,wiggle格式0-based coordinate system ：序列的第一个碱基设为数字0，如BAM, BCFv2, BED, PSL格式

3. ID- identifier: variant的ID。比如在dbSNP中有该SNP的id，则会在此行给出；若没有，则用’.'表示其为一个novel variant。

4. REF- reference base(s):参考碱基，染色体上面的碱基，必须是ATCGN中的一个，N表示不确定碱基

5. ALT- alternate base(s):与参考序列比较发生突变的碱基

6. QUAL- quality: Phred格式(Phred_scaled)的质量值，表示在该位点存在variant的可能性；该值越高，则variant的可能性越大；计算方法：Phred值 = -10 * log (1-p)p为variant存在的概率; 通过计算公式可以看出值为10的表示错误概率为0.1，该位点为variant概率为90%。

7. FILTER- _filter status: 使用上一个QUAL值来进行过滤的话，是不够的。GATK能使用其它的方法来进行过滤，过滤结果中通过则该值为”PASS”;若variant不可靠，则该项不为”PASS”或”.”。

8. INFO - additional information: 这一行是variant的详细信息，具体如下：

#DP-read depth：样本在这个位置的reads覆盖度。是一些reads被过滤掉后覆盖度。DP4:高质量测序碱基，位于REF或者ALT前后
#QD：通过深度来评估一个变异的可信度。Variant call confidence normalized by depth of sample reads supporting a variant
#MQ：表示覆盖序列质量的均方值RMS Mapping Quality
#FQ：phred值关于所有样本相似的可能性
#AC，AF和 AN：AC(Allele Count)表示该Allele的数目；AF(Allele Frequency)表示Allele的频率； AN(Allele Number)表示Allele的总数目。
对于1个diploid sample而言：则基因型 0/1表示sample为杂合子，Allele数为1(双倍体的sample在该位点只有1个等位基因发生了突变)，
Allele的频率为0.5(双倍体的sample在该位点只有50%的等位基因发生了突变)，总的Allele为2； 基因型 1/1则表示sample为纯合的，Allele数为2，Allele的频率为1，总的Allele为2。
#MLEAC：Maximum likelihood expectation (MLE) for the allele counts (not necessarily the same as the AC), for each ALT allele, in the same order as listed
#MLEAF：Maximum likelihood expectation (MLE) for the allele frequency (not necessarily the same as the AF), for each ALT allele, in the same order as listed
#BaseQRankSum 比较支持变异的碱基和支持参考基因组的碱基的质量，负值表示支持变异的碱基质量值不及支持参考基因组的，
正值则相反，支持变异的质量值好于参考基因组的。0表示两者无明显差异。
FS使用F检验来检验测序是否存在链偏好性。链偏好性可能会导致变异等位基因检测出现错误。输出值Phred-scaled p-value，值越大越可能出现链偏好性。使用Fisher’s精确检验来检测strand bias而得到的Fhred格式的p值，该值越小越好；如果该值较大，表示strand bias（正负链偏移）越严重，即所检测到的variants位点上，reads比对到正负义链上的比例不均衡。一般进行filter的时候，推荐保留FS<10~20的variants位点。GATK可设定FS参数。
#InbreedingCoeff 使用似然法检验样本间的近交系数（又或者称为近亲关系）。值越高越可能是近亲繁殖。
#MQRankSum 比较支持变异的序列和支持参考基因组的序列的质量，负值表示支持变异的碱基质量值不及支持参考基因组的，只针对杂合。
正值则相反，支持变异的质量值好于参考基因组的。0表示两者无明显差异。实际应用中一般过滤掉较小的负值。
#BaseCounts 所有样本在变异位点ATCG的数量
#ClippingRankSum 同前面两个类似，负值表示支持变异的read有更的的hard-clip碱基，正值表示支持参考基因组的的read有更多的hard-clip。0最好，无论是正值还是负值都表示可能可能存在人为偏差。
#ReadPosRankSum 检测变异位点是否有位置偏好性（是否存在于序列末端，此时往往容易出错）。最佳值为0，表示变异与其在序列上的位置无关。负值表示变异位点更容易在末端出现，正值表示参考基因组中的等位基因更容易在末端出现。
#ExcessHet 检测这些样本的相关性，与InbreedingCoeff相似，值越大越可能是错误。
#LikelihoodRankSum 评价支持变异和ref的序列与best hyplotype的匹配性，0为最佳值。负值表示支持变异的read匹配度不及支持ref的匹配度，正值则相反。值越大表示越可能是出现了错误。
#HaplotypeScore 分数越高越可能出现错误。Higher scores are indicative of regions with bad alignments, typically leading to artifactual SNP and indel calls.
#SOR：也是一个用来评估是否存在链偏向性的参数，相当于FS的升级版。The StrandOddsRatio annotation is one of several methods that aims to evaluate whether there is strand bias in the data. It is an updated form of the Fisher Strand Test that is better at taking into account large amounts of data in high coverage situations. It is used to determine if there is strand bias between forward and reverse strands for the reference or alternate allele. The reported value is ln-scaled.
#IS：插入缺失或部分插入缺失的reads允许的最大数量
#G3：ML 评估基因型出现的频率
#HWE：chi^2基于HWE的测试p值和G3
#CLR：在受到或者不受限制的情况下基因型出现可能性log值
#UGT：最可能不受限制的三种基因型结构
#CGT：最可能受限制三种基因型的结构
#PV4：四种P值得误差，分别是（strand、baseQ、mapQ、tail distance bias）
#INDEL：表示该位置的变异是插入缺失
#PC2：非参考等位基因的phred（变异的可能性）值在两个分组中大小不同
#PCHI2：后加权chi^2，根据p值来测试两组样本之间的联系
#QCHI2：Phred scaled PCHI2
#PR：置换产生的一个较小的PCHI2
#QBD：Quality by Depth，测序深度对质量的影响
#RPB：序列的误差位置（Read Position Bias）
#MDV：样本中高质量非参考序列的最大数目
#VDB：Variant Distance Bias，RNA序列中过滤人工拼接序列的变异误差范围

9. FORMAT 和最后一列sample中的信息是对应的

#AD 和 DP：AD(Allele Depth)为sample中每一种allele的reads覆盖度,在diploid中则是用逗号分割的两个值，
前者对应ref基因型，后者对应variant基因型； DP（Depth）为sample中该位点的覆盖度。
#GT：样品的基因型（genotype）。两个数字中间用’/'分 开，这两个数字表示双倍体的sample的基因型。0 表示样品中有ref的allele；
1表示样品中variant的allele； 2表示有第二个variant的allele。因此： 0/0表示sample中该位点为纯合的，和ref一致； 0/1表示sample中该位点为杂合的，有ref和variant两个基因型； 1/1表示sample中该位点为纯合的，和variant一致。1/2表示sample中该位点为杂合突变，有ALT1和ALT2两个基因型（部分和ALT1碱基类型一致，部分和ALT2碱基类型一致）
#GQ：即第二可能的基因型的PL值，相对于最可能基因型的PL值（其PL=0）而言，大于99时，其信息量已不大，因此大于99的全部赋值99。当GQ值很小时，意味着第二可能基因型与最可能基因型差别不大。
#GL：三种基因型（RR RA AA）出现的可能性，R表示参考碱基，A表示变异碱基
#DV：高质量的非参考碱基
#SP：phred的p值误差线
#PL：指定的三种基因型的可能性(provieds the likelihoods of the given genotypes)。这三种指定的基因型为(0/0,0/1,1/1)，这三种基因型的概率总和为1。

0/1:889,0,216 
0/1:94,0,940 
1/1:269,18,0 
1/1:580,54,0 
1/2:3365,1522,1357,1842,0,1706 
1/2:307,190,178,117,0,104 
（0/0型3个数字，第一个为0 
0/1型3个数字，中间为0 
1/1型3个数字，最后一个为0 
1/2型6个数字，倒数第二个为0）

和之前不一致，该值越大，表明为该种基因型的可能性越小。 Phred值 = -10 * log § p为基因型存在的概率。