CUT&Tag数据分析注意要点及流程

最新推荐文章于 2025-03-04 15:13:01 发布

小兔叽乖乖

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文章标签： linux

本文链接：https://blog.csdn.net/m0_70611557/article/details/132624881

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参考流程：CUT&Tag Data Processing and Analysis Tutorial

1. 测序片段前10bp存在质量波动属于正常现象无需修剪

2. CUT&Tag不需要进行PCR去重

数据分析流程：

所选择的比对参数：

bowtie2 -p 20 --end-to-end --very-sensitive --no-mixed --no-discordant --phred33 -I 10 -X 700

可以用来对CUT&Tag数据做peakcalling的软件，我仍然选择使用macs系列

参数：

macs3 callpeak -t bam -q 0.05 -f BAMPE --keep-dup all -g hs -n

（自己总结的经验，如有错误请纠正）

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Deepseek问答：我有一个表观方向的课题，如何选择ChIP-seq,CUT&Tag，ATAC-seq等技术

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上图是我得到的结果，下图是教程的结果，比对结果有一些差异，我也不知道具体原因是啥。谷歌了一下，发现原因可能是因为环境变量的问题，系统不知道picard的具体位置，需要设置全局环境变量，遂查了一下picard的位置。我发现我做出来的结果测序深度一致，但是比对的结果有一点差异，不知道是我的操作问题，还是参考基因组更新了导致比对结果出现了些许不同。上图是我得到的结果，下图是教程的结果，除了IgG_rep1外比对结果一致。上图是我的结果，下图是教程的结果，结果不太一致，不知道是具体的原因是什么。

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最终，对测序后的文库进行生物信息学分析，良好的单细胞CUT&Tag数据特征表现为理想的细胞捕获量、有着与核小体分布一致的规律，包括单核小体、双核小体和三核小体的捕获、在每个细胞中捕获的unique fragments数量应足够多、有较好的分群效果能够区别不同的细胞类型、能够揭示细胞状态的多样性等。传统的CUT&Tag通常是在大量细胞中进行实验，可能掩盖了细胞间的异质性，虽然CUT&Tag理论上也可以实现单个细胞层面的解析，但是由于通量的限制和实验操作的难度也并未得到很好的推广和应用。

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CUT&Tag是研究蛋白和DNA互作新兴的实验方法，该方法是通过蛋白特异性抗体引导Protein A-Tn5酶精确切割目标蛋白结合的DNA区域，并在这些序列的两端加上测序接头，经过PCR扩增后形成可用于高通量测序的文库，随后对文库进行测序分析从而解析与目标蛋白结合的DNA片段。，即哪些区域对转录因子和其他调控蛋白是可及的，它可以用于研究基因调控网络、细胞类型特异性的染色质状态以及疾病状态下的表观遗传变化。，可以提供更详细的蛋白-染色质相互作用信息，有助于深入理解蛋白在基因调控中的具体作用机制；

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### 使用 CUT&Tag 进行数据分析的方法和工具 #### 工具准备为了进行基于CUT&Tag技术的数据分析，需先准备好一系列必要的生物信息学工具。这些工具不仅有助于数据预处理，还支持后续的统计分析与可视化工作。 - **SRA Toolkit**: 用于从NCBI SRA数据库下载原始测序数据[^1]。 - **Bowtie2**: 实现快速而灵敏的读段比对到参考基因组上。 - **SAMtools 和 BEDTools**: 处理并转换由 Bowtie2 输出的 SAM/BAM 文件至其他格式以便进一步操作，如提取特定区域的信息或计算覆盖度等。 - **MACS2**: 鉴定 ChIP-seq 或者在此情况下 CUT&Tag 的 peak 峰位置，从而识别潜在的目标位点。 - **R 和 Ngsplot/Deeptools**: 提供强大的图形表示功能，可用于生成热图、密度分布图等多种类型的图表来直观呈现实验结果；同时也具备丰富的包库来进行高级别的统计测试以及机器学习建模等工作流的支持。 #### 数据处理流程概述当获取到了经过质量控制后的 clean reads 后，则按照以下顺序依次执行各项任务： - 利用 `bowtie2` 将序列映射回相应的物种全基因组序列； - 对齐好的 bam 文件利用 samtools sort/index 排序索引，并通过 bedtools 获得目标区间内的 read counts 计数矩阵； - 应用 macs2 callpeak 寻找显著富集区段（peaks），进而得到可能存在的转录因子结合位点列表； - 结合 RNA-seq 表达谱资料找出共同变化趋势明显的候选调控元件集合，并借助 venn diagram 展示两者间的关系模式[^2]。 ```bash # 下载样本数据 prefetch --option-file sample_accessions.txt # 解压 fastq 格式的压缩包 fastq-dump --split-files *.sra # 构建 bowtie2 索引 bowtie2-build /path/to/reference_genome.fa ref_index # 执行比对过程 bowtie2 -x ref_index -U input.fastq -S output.sam # Bam 文件排序加索引 samtools view -bS output.sam | samtools sort -o sorted.bam - samtools index sorted.bam # Peak calling with MACS2 macs2 callpeak -t treated_samples.bed -c control_sample.bed \ -f BED -g hs -n experiment_name # Venn Diagram generation using R package 'VennDiagram' library(VennDiagram) draw.pairwise.venn(area1=length(setA), area2=length(setB), cross.area=length(intersect(setA,setB))) ```