干货 | 探索CUT&Tag：从样本到文库，实验步步为营！

CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是一种新型DNA-蛋白互作研究技术，主要用于研究转录因子或组蛋白修饰在全基因组上的结合或分布位点。相比于传统的ChIP-seq技术，CUT&Tag反应在细胞内进行，创新性地使用了ProteinA/G-Tn5融合蛋白来结合目的蛋白上的抗体，并特异性切割目的蛋白结合的DNA，最终通过结合NGS实现靶蛋白结合位点的精准定位。

图1. CUT&Tag技术原理示意图

CUT&Tag和ChIP 技术的实验原理类似，均利用抗体与目标蛋白特异性结合来富集与之相互作用的DNA片段。CUT&Tag技术的核心是将Tn5转座酶进行改造，融合proteinA/G（形成pA/G-Tn5融合蛋白），其优点是特异性强，灵敏度高，背景噪音较低，重复性好，并且对样本要求量少。现在，CUT&Tag已成为组蛋白翻译后修饰（PTM）和从包括单细胞在内的少数细胞中选择转录因子的强大分析技术。

在CUT&Tag实验过程中如何保证实验的成功率呢？爱基在这里给您提供一些小tips。接下来让我们来为您详细介绍CUT&Tag的基本操作步骤、实验设计要点和关键优化环节。

1. 样本的制备

“良好的开端是成功的一半”，CUT&Tag实验的成功与否很大程度上取决于细胞的活性及细胞核的状态。如果细胞活力太低或者细胞核状态不佳可能会导致蛋白质和DNA的结合状态发生改变，进而可能引起部分蛋白质脱落，使得DNA处于裸露状态从而引发非特异性的切割事件。为了避免这种情况，追求更高的信噪比，建议选取新鲜细胞及组织进行细胞核制备。针对细胞样本在实验前要保证细胞状态良好，无菌类及支原体污染，台盼蓝染色检测细胞活率>85%，悬浮细胞通过离心弃上清来收集细胞沉淀，贴壁细胞根据细胞的特性可选择胰酶消化或细胞刮刮取来收集细胞。针对动植物组织建议提取细胞核，常规的动物组织一般选择匀浆过细胞筛后用NP-40、TritonX-100、Tween20、 Digitonin等进行常规裂解，对于难裂解的组织类型可适当增加表面活性剂的浓度；对于植物组织和真菌的核提取可参考“破解植物和真菌ATAC-seq技术难关”一文。最终要求细胞核形态保证完整，细胞核悬液背景干净。

图2.爱基细胞核制备结果展示

2. 磁珠活化

ConA磁珠激活，该步骤需要15min。磁珠的储存条件为4℃，为了确保磁珠的性能，在使用前应提前把磁珠取出放置室温平衡。通过使用Binding buffer活化磁珠，来提高磁珠结合细胞核的能力。如果有多个CUT&Tag样本处理，为了确保反应的一致性和准确性，建议首先在单个1.5-2 mL离心管中批量处理所有反应需要的ConA磁珠，之后再将磁珠分装到8连排的PCR管中，这样可以确保每个样本中磁珠的数量和活性保持一致，从而提高实验结果的可比性和可靠性。

3. 磁珠与细胞核结合

激活的ConA磁珠与细胞核结合，该步骤需要10-15min，根据样本的结合情况适当调整结合时间。在此过程中可能会观察到磁珠沉底的现象，此时可以用枪头轻轻吸打混匀保证细胞核与磁珠充分结合。结合后建议用显微镜进行检查，以确认细胞核与磁珠的结合效率。理想情况下，ConA磁珠与细胞核的结合效率应>95%。

图3.  A 细胞核提取后显微镜观察;  B 显微镜观察CoA磁珠与细胞核结合;  C 多个样本CUT&Tag 实验

4.一抗结合

在进行CUT&Tag等DNA-蛋白互作实验时，选择合适的一抗至关重要。推荐选用ChIP级别的抗体进行CUT&Tag实验，在抗体选用时可以用Westernblot辅助选择。如果无市售的ChIP级抗体，可以尝试Immune Fluorescence(IF)级别的抗体。新类型的抗体，因浓度各异，效价未知，第一次实验时，需测试抗体最佳使用浓度。组蛋白抗体推荐稀释比例为1:100；转录因子抗体推荐稀释比例为1:50；转基因标签抗体（HA、myc、Flag、GFP）推荐稀释比例为1:50。抗体的用量根据研究的目的蛋白表达的丰度进行调整，蛋白表达丰度较低的样本可增加抗体用量；如遇抗体浓度较低的情况，可选择增加抗体的投入量，抗体投入总量至多不应超过5ul。

抗体富集效率对实验结果有着至关重要的影响。该步骤在孵育条件上有两个选择：室温孵育1-2h，或4℃过夜的形式。根据目前实验经验来看两种孵育方式没有太大的差异，老师们可以根据自己的规划进行选择和调整。

5.二抗结合

在一抗孵育过夜后，接下来应该添加针对一抗物种同种型的二抗（例如抗兔、抗小鼠），以帮助在抗体结合位点更有效地标记。用添加了Digitonin的Wash buffer 按照一定比例稀释二抗，常规推荐稀释比例为1:100。孵育条件为室温，该步骤需要1小时，为了确保孵育更加的充分，建议将样本放置在静音混合器上进行孵育。

6.pA/G-Tn5孵育

pA/G-Tn5在室温下旋转孵育，不同的实验环境，转座子的切割活性不同，因此可根据实际情况来调整转速。切记该反应Buffer里不能添加Mg2+以避免Tn5过早激活。在此过程中磁珠会出现结块的现象，这时建议用枪头轻轻吹打分散。为减少样本的损失，应及时观察孵育情况，确保样本不会过多残留在管盖或管壁上。整个孵育步骤应持续1小时，以确保充分的酶切反应。

图4. A 静音混合器;  B 盖子磁珠残留;  C样本磁珠结块现象

7. pA/G-Tn5酶切，DNA提取

在此过程中维持酶活性的工作条件是至关重要的。建议在恒温混匀仪上进行这一步骤，以确保酶切反应的稳定性和一致性。酶切后向反应体系中加入反应液和磁珠（吸附DNA），终止酶切反应并释放DNA。需要注意的是，反应液中含有的SDS成分会导致溶液变得粘稠，这会导致液体粘连在枪头内壁，记得小心操作减少损失。释放后的DNA片段会结合在磁珠上，含有的SDS需要清洗干净防止其干扰PCR建库。

图5 文库质检结果，片段集中在200-500bp 呈现周期性规律

最后让我们来看一下爱基的实测数据吧：

图6. CUT&Tag酶切片段分布，转录因子/组蛋白修饰的酶切片段分布呈现周期性;

图7. reads密度分布图，reads在TSS附近呈现明显的富集；

图8. 功能元件分布图Peak在基因功能元件上分布;

图9. Peak可视化;

 总  结 

探索CUT&Tag技术的过程是精确而系统的，从样本制备到文库构建，每一步都需严格把控。选择新鲜的样本、适当的抗体、优化磁珠处理、精确控制酶切条件，这些关键步骤共同确保了CUT&Tag的高效富集和准确分析。

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