「用一个更复杂的例子，来深入学习DESeq2差异表达分析后的小分析」

这篇文章，对Griffith Lab的DESeq2分析流程做一个解读。

理解数据

Griffith Lab所使用的基因表达量矩阵总共包含了54个sample，这些sample可以划分为1）normal，2）primary tumor以及3）colorectal cancer metastatic in the liver

从差异分析之后开始

获取差异表达分析的结果

在使用DESeq()函数完成差异表达分析之后（此处还是DESeq对象），获取其分析结果，需要用到函数results()。

同时，想要提取对应组合差异表达分析的结果，需要用到contrast=c()参数，

Note：

• contrast()的输入为3个字符串向量，1）colData中包含样本分类信息的列，2）分组1（log2FoldChange的分子），3）分组2（log2FoldChange的分母）。

• 可以使用summary()对创建的DESeq对象进行一些参数统计，e.g.

  上调基因的数量

  下调基因的数量

  离群gene占比

  被判定为low counts的gene占比

MA plot怎么画？

以下面这张图为例，

• x轴为，gene标准化后对应的read counts

• y轴为，2组实验条件下gene表达量的倍数，以$lo{g}_2$形式呈现

  log2FoldChange>0，代表在分组1中为上调，分组2中为下调

  log2FoldChange<0，代表在分组2中为下调，分组2中为上调

这张MA plot中的red dot代表表达量呈现显著差异的gene，grey dot代表表达量没有呈现显著差异的gene。

Note：$$lo{g}_2(正常形式的倍数)=thisvalue$$

用DESeq2自带代码画MA plot

绘图代码如下，

# 直接画就行
plotMA(deseq2Results)

用ggplot2画MA plot

1、使用ggplot2仿着plotMA

绘图结果如下，

绘图代码如下，

library(ggplot2)
library(scales) # needed for oob parameter
library(viridis)

# 1.将DESeq结果转换为dataframe
deseq2ResDF <- as.data.frame(deseq2Results)
# 2. 对gene添加“是否呈现显著差异表达”的标签
deseq2ResDF$significant <- ifelse(deseq2ResDF$padj < .1, "Significant", NA)
# 以baseMean作为x，log2FoldChange作为y
# 以significant作为分类变量
ggplot(deseq2ResDF, aes(baseMean, log2FoldChange, colour=significant)) + 
	geom_point(size=1) + 
	scale_y_continuous(limits=c(-3, 3), oob=squish) + 
	scale_x_log10() + 
	geom_hline(yintercept = 0, colour="tomato1", size=2) + 
	labs(x="mean of normalized counts", y="log fold change") + 
	scale_colour_manual(name="q-value", values=("Significant"="red"), na.value="grey50") +
	theme_bw()

在绘图细节上，有几个需要注意的地方，

• 导入library(scales)之后，在scale_y_continuous()处添加的oob=squish参数，不会将超出所设置的y轴范围之外的点排除（即转变为NA），而是将它们“挤”在边缘
  

• 设置scale_x_log10()，将baseMean转换为以10为底的对数

2、ggplot2高级版

绘图结果如下，

绘图代码如下，

library(viridis)
ggplot(deseq2ResDF, aes(baseMean, log2FoldChange, colour=padj)) + 
	geom_point(size=1) + 
	scale_y_continuous(limits=c(-3, 3), oob=squish) + 
	scale_x_log10() + 
	geom_hline(yintercept = 0, colour="darkorchid4", size=1, linetype="longdash") + 
	labs(x="mean of normalized counts", y="log fold change") + 
	scale_colour_viridis(direction=-1, trans='sqrt') + 
	theme_bw() + 
	geom_density_2d(colour="black", size=2)

增添了2个函数，

• scale_colour_viridis()，针对的是映射函数中设置的colour=选项。

  此处将padj，即FDR矫正过后的p-value，呈现为一个梯度变化的可视化结果（从紫到黄，即代表了从非常不显著到极显著）

  direction=设置颜色的梯度走向，若设置为1，与上述结果呈现相反的走向
  

• geom_density_2d()

  函数的说明书在这了：https://ggplot2.tidyverse.org/reference/geom_density_2d.html

单个基因的表达量变化怎么画？

绘图部分

先使用plotCounts()函数，将对应gene的表达量数据提取出来，

otop2Counts <- plotCounts(deseq2Data, 
                          gene="ENSG00000183034", 
                          intgroup=c("tissueType", "individualID"), 
                          returnData=TRUE)

需要给定intgroup=c()指定参数，

• 第一个参数为colData中的样本分类信息列名（e.g. 此处的为tissueType，还有很多其他的例子，使用的是condition）
• 第二个参数为样本 ID信息

绘图代码如下，

colourPallette <- c("#7145cd","#bbcfc4","#90de4a","#cd46c1","#77dd8e","#592b79","#d7c847","#6378c9","#619a3c","#d44473","#63cfb6","#dd5d36","#5db2ce","#8d3b28","#b1a4cb","#af8439","#c679c0","#4e703f","#753148","#cac88e","#352b48","#cd8d88","#463d25","#556f73")

ggplot(otop2Counts, aes(x=tissueType, y=count, colour=individualID, group=individualID)) + 
	geom_point() + 
	geom_line() + 
	theme_bw() + 
	theme(axis.text.x=element_text(angle=15, hjust=1)) + 
	scale_colour_manual(values=colourPallette) +  # 将已经调好的颜色传递给scale_colour_manual()
	guides(colour=guide_legend(ncol=3)) + 
	ggtitle("OTOP2")

绘图结果如下，

「这个图好看的点，我自己觉得有两个，设置了2个分组，让结果非常清晰」

验证read counts部分

deseq2ResDF["ENSG00000183034",]
rawCounts["ENSG00000183034",]
normals=row.names(sampleData[sampleData[,"tissueType"]=="normal-looking surrounding colonic epithelium",])
primaries=row.names(sampleData[sampleData[,"tissueType"]=="primary colorectal cancer",])
# 在normal组织中的raw counts
rawCounts["ENSG00000183034",normals]
# 在primary tumor中的raw counts
rawCounts["ENSG00000183034",primaries]

热图怎么画？

基础热图

绘制代码如下，

# 将DESeq对象进行variance stablilizing transform
deseq2VST <- vst(deseq2Data)

# 再将结果转换为dataframe
deseq2VST <- assay(deseq2VST)
deseq2VST <- as.data.frame(deseq2VST)
# 获取gene ID
deseq2VST$Gene <- rownames(deseq2VST)
# head(deseq2VST)

Note：assay()的作用？这边就不展开将了，先给自己挖一个坑，以后会写一篇关于这个的实战。

学习资料先放在这里：https://bioconductor.org/help/course-materials/2019/BSS2019/04_Practical_CoreApproachesInBioconductor.html

# 只保留log2FoldChaneg > 3的差异表达基因
sigGenes <- rownames(deseq2ResDF[deseq2ResDF$padj <= .05 & abs(deseq2ResDF$log2FoldChange) > 3,])
deseq2VST <- deseq2VST[deseq2VST$Gene %in% sigGenes,]

# 数据类型转换：width to long
library(reshape2)
deseq2VST_wide <- deseq2VST
deseq2VST_long <- melt(deseq2VST, id.vars=c("Gene"))

# 覆盖原始VST数据
deseq2VST <- melt(deseq2VST, id.vars=c("Gene"))

# 绘制热图
# 以样本作为x，gene ID作为y，填充值映射到fill
heatmap <- ggplot(deseq2VST, aes(x=variable, y=Gene, fill=value)) + 
	geom_raster() + 
	scale_fill_viridis(trans="sqrt") + 		
	theme(axis.text.x=element_text(angle=65, hjust=1), 
          axis.text.y=element_blank(),
          axis.ticks.y=element_blank())
# heatmap

使用的函数为

• geom_raster()，将颜色映射到每一个区块的数值（类似函数为geom_tile()）

  官方说明文档：https://ggplot2.tidyverse.org/reference/geom_tile.html

添加聚类树的热图

# 将长数据类型转换为宽数据类型
deseq2VSTMatrix <- dcast(deseq2VST, Gene ~ variable)
rownames(deseq2VSTMatrix) <- deseq2VSTMatrix$Gene
deseq2VSTMatrix$Gene <- NULL

# 计算距离，没印象的看看多元统计
# 以下分别基于gene和sample进行了距离计算
distanceGene <- dist(deseq2VSTMatrix)
distanceSample <- dist(t(deseq2VSTMatrix))  # 转置后再计算

# 根据上一步计算得到的距离进行聚类分析
clusterGene <- hclust(distanceGene, method="average")
clusterSample <- hclust(distanceSample, method="average")

# 构建基于sample的聚类树
# install.packages("ggdendro")
library(ggdendro)
sampleModel <- as.dendrogram(clusterSample)
sampleDendrogramData <- segment(dendro_data(sampleModel, 
                                            type = "rectangle"))
sampleDendrogram <- ggplot(sampleDendrogramData) + 
	geom_segment(aes(x = x, y = y, xend = xend, yend = yend)) + 
	theme_dendro()

# 将sample聚类结果添加到原始数据集中
deseq2VST$variable <- factor(deseq2VST$variable, 
                  levels=clusterSample$labels[clusterSample$order])

# 绘制聚类树
library(gridExtra)
grid.arrange(sampleDendrogram, heatmap, ncol=1, heights=c(1,5))

需要额外用到的几个R packages，

• ggdendro
• gridExtra

绘图结果如下，

但是上述添加到原始图层上的树，和heatmap中sample所对应的位置实际上是不一样的，

精修代码如下，

library(gtable)
library(grid)

# Modify the ggplot objects
sampleDendrogram_1 <- sampleDendrogram + scale_x_continuous(expand=c(.0085, .0085)) + scale_y_continuous(expand=c(0, 0))
heatmap_1 <- heatmap + scale_x_discrete(expand=c(0, 0)) + scale_y_discrete(expand=c(0, 0))

# Convert both grid based objects to grobs
sampleDendrogramGrob <- ggplotGrob(sampleDendrogram_1)
heatmapGrob <- ggplotGrob(heatmap_1)

# Check the widths of each grob
sampleDendrogramGrob$widths
heatmapGrob$widths

# Add in the missing columns
sampleDendrogramGrob <- gtable_add_cols(sampleDendrogramGrob, heatmapGrob$widths[7], 6)
sampleDendrogramGrob <- gtable_add_cols(sampleDendrogramGrob, heatmapGrob$widths[8], 7)

# Make sure every width between the two grobs is the same
maxWidth <- unit.pmax(sampleDendrogramGrob$widths, heatmapGrob$widths)
sampleDendrogramGrob$widths <- as.list(maxWidth)
heatmapGrob$widths <- as.list(maxWidth)

# Arrange the grobs into a plot
finalGrob <- arrangeGrob(sampleDendrogramGrob, heatmapGrob, ncol=1, heights=c(2,5))

# Draw the plot
grid.draw(finalGrob)



# Re-order the sample data to match the clustering we did
sampleData_v2$Run <- factor(sampleData_v2$Run, levels=clusterSample$labels[clusterSample$order])

# Construct a plot to show the clinical data
colours <- c("#743B8B", "#8B743B", "#8B3B52")
sampleClinical <- ggplot(sampleData_v2, aes(x=Run, y=1, fill=Sample.Characteristic.biopsy.site.)) + 
	geom_tile() + 
	scale_x_discrete(expand=c(0, 0)) + 
	scale_y_discrete(expand=c(0, 0)) + 
	scale_fill_manual(name="Tissue", values=colours) +
	theme_void()

# Convert the clinical plot to a grob
sampleClinicalGrob <- ggplotGrob(sampleClinical)

# Make sure every width between all grobs is the same
maxWidth <- unit.pmax(sampleDendrogramGrob$widths, heatmapGrob$widths, sampleClinicalGrob$widths)
sampleDendrogramGrob$widths <- as.list(maxWidth)
heatmapGrob$widths <- as.list(maxWidth)
sampleClinicalGrob$widths <- as.list(maxWidth)

# Arrange and output the final plot
finalGrob <- arrangeGrob(sampleDendrogramGrob, sampleClinicalGrob, heatmapGrob, ncol=1, heights=c(2,1,5))
grid.draw(finalGrob)

参考资料

[1] https://genviz.org/module-04-expression/0004/02/01/DifferentialExpression/