DESeq2筛选差异OTU及绘制火山图

1.DESeq包安装

install.packages("BiocManager")
library(BiocManager)
BiocManager::install("DESeq2")
library(DESeq2)

2.数据准备

共需要两份数据文件

a.OTU丰度表格，otutab.txt；(每一列为一个样本，每一行为一种OTU，交叉区域为每种OTU在各样本中的丰度,DESeq2计算时只能识别整数，不识别小数，所以请不要使用相对丰度表格)

b.样本分组信息表格，即metadata.txt。(行为样本名称，第二列为各样本对应的分组信息)

3.常规流程

a. 读入文件

otu_file <- read.delim('otutab.txt', row.names = 1, sep = '\t', stringsAsFactors = FALSE, check.names = FALSE)
group_file <- read.delim('metadata.txt', row.names = 1, sep = '\t')

b. 使用?? DESeq2参阅官方说明文档中的常规流程

Step 1，使用DESeqDataSet()，构建DESeq2存储read数的数据集；

Step 2，使用DESeq()，基于负二项式（Negative Binomial或称 Gamma-Poisson）分布，对数据（本示例中为OTU丰度数据）进行DESeq差异分析；

Step 3，使用results()，用于在DESeq分析中提取结果。

library(DESeq2)
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = otu_file, colData = group_file, design = ~group)#构建 DESeqDataSet 对象  
dds <- DESeq(dds) #差异分析
suppressMessages(dds)

c.结果查看

接下来，我们要查看总体结果，并根据p-value进行重新排序。利用summary命令统计显示一共多少个OTU上调和下调

res <- results(dds, contrast=c('group', 'treat', 'control'))#提取分析结果
res = res[order(res$pvalue),]
res #查看结果
summary(res)  #简要统计结果
table(res$padj<0.05) #查看fdr校正后的P<0.05的个数

d.提取差异OTU并进行注释

获取padj（p值经过多重校验校正后的值）小于0.05，表达倍数取以2为对数后大于1或者小于-1的差异OTU

diff_OTU_deseq2 <-subset(res, padj < 0.05 & abs(log2FoldChange) > 1)
#或
# diff_OTU_deseq2 <-subset(res,padj < 0.05 & (log2FoldChange > 1 | log2FoldChange < -1))
dim(diff_OTU_deseq2)
head(diff_OTU_deseq2)
write.csv(diff_OTU_deseq2,file= "DEG_treat_vs_control.csv")

e.合并结果

resdata <-  merge(as.data.frame(res),as.data.frame(counts(dds,normalize=TRUE)),by="row.names",sort=FALSE)
write.table(resdata,file= "DESeq2_Group_genus.txt",sep="\t",quote=F,row.names=F)

4.火山图绘制

首先在上文得到的转化为数据框类型的DESeq2差异分析结果“resdata”的基础上，根据其中log2FoldChange、padj这两个重要的指标，对OTU进行分类.

for (i in 1:nrow(resdata)) {
    if (abs(resdata[i,'log2FoldChange']) >= 0.5) resdata[i,'select_change'] <- 'y' else resdata[i,'select_change'] <- 'n'
    if (resdata[i,'padj'] %in% NA | abs(resdata[i,'padj']) >= 0.05) resdata[i,'select_pvalue'] <- 'n' else resdata[i,'select_pvalue'] <- 'y'
    resdata[i,'select'] <- paste(resdata[i,'select_change'], resdata[i,'select_pvalue'], sep = '')
}

对于每个OTU，若log2FoldChange < 0.5，即该OTU在两组间的丰度差异倍数低于2（默认情况下，将差异倍数2判定为分界点），则在“resdata”的“select_change”列标记为“n”，反之为“y”；若padj >= 0.05，即校正后的显著性p值未低于0.05的显著性水平，则在“resdata”的“select_pvalue”列标记为“n”，反之为“y”。

同时合并“select_change”和“select_pvalue”的结果，可得到“nn”（p >= 0.05，FC < 2）、“ny”（p < 0.05，FC < 2）、“yn”（p >= 0.05，FC >= 2）、“yy”（p < 0.05，FC >= 2）四种组合。

library(ggplot2)
 
##ggplot2 差异火山图
resdata$select <- factor(resdata$select, levels = c('nn', 'ny', 'yn', 'yy'), labels = c('p >= 0.05, FC < 2', 'p < 0.05, FC < 2', 'p >= 0.05, FC >= 2', 'p < 0.05, FC >= 2'))
 
#纵轴为显著性 p 值
volcano_plot_pvalue <- ggplot(resdata, aes(log2FoldChange, -log(padj, 10))) +
geom_point(aes(color = select), alpha = 0.6) +
scale_color_manual(values = c('gray30', 'green4', 'red2', 'blue2')) +
theme(panel.grid = element_blank(), panel.background = element_rect(color = 'black', fill = 'transparent')) +
theme(legend.title = element_blank(), legend.key = element_rect(fill = 'transparent'), legend.background = element_rect(fill = 'transparent')) +
geom_vline(xintercept = c(-0.5, 0.5), color = 'gray', size = 0.5) + 
geom_hline(yintercept = -log(0.05, 10), color = 'gray', size = 0.5) +
labs(x = 'log2 Fold Change', y = '-log10 p-value')
 
ggsave('volcano_plot_pvalue.png', volcano_plot_pvalue, width = 6, height = 5)

第二种绘图方式

 可在火山图上添加标签，以我的数据为例。ggplot中，可使用ggreprel包中的geom_text_repel()函数进行标签的添加。

with(resdata, plot(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=20, main="Volcano plot", xlim=c(-2.5,4)))

# Add colored points: red if padj<0.05, orange of log2FC>1, green if both)
with(subset(resdata, padj<.05 ), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=20, col="red"))
with(subset(resdata, abs(log2FoldChange)>1), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=20, col="orange"))
with(subset(resdata, padj<.05 & abs(log2FoldChange)>1), points(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=20, col="green"))

# Label points with the textxy function from the calibrate plot
library(calibrate)
with(subset(resdata, padj<.05 & abs(log2FoldChange)>1.5), textxy(log2FoldChange, -log10(pvalue), labs=ID, cex=.8))

绘图方式三

# rm(list = ls()) 此步骤为清空R环境，非必要不使用
library(ggplot2)
resdata$color <- ifelse(resdata$padj<0.05 & abs(resdata$log2FoldChange)>= 1,ifelse(resdata$log2FoldChange > 1,'red','blue'),'gray')
color <- c(red = "red",gray = "gray",blue = "blue")

p <- ggplot(resdata, aes(log2FoldChange, -log10(padj), col = color)) +
  geom_point() +
  theme_bw() +
  scale_color_manual(values = color) +
  labs(x="log2 (fold change)",y="-log10 (q-value)") +
  geom_hline(yintercept = -log10(0.05), lty=4,col="grey",lwd=0.6) +
  geom_vline(xintercept = c(-1, 1), lty=4,col="grey",lwd=0.6) +
  theme(legend.position = "none",
        panel.grid=element_blank(),
        axis.title = element_text(size = 16),
        axis.text = element_text(size = 14))
p

参考来源：科学网—lyao222lll的个人资料；

RNA-seq(7): DEseq2筛选差异表达基因并注释(bioMart) - 简书

关于EdgeR分析差异OTU详见博文https://www.jianshu.com/p/e6bc48d8573e

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