DDR1 和 DDR2 双靶点抑制剂的设计合成及其抗炎作用研究

   DDR1 主要包括 DDR1a、DDR1b、DDR1c、DDR1d 和 DDR1e 五个亚型，亚型的不同主要是由跨膜激酶蛋白的 mRNA 选择性剪接所导致，而 DDR2 至今尚未发现其它亚型。DDRs 在人和小鼠组织中表达广泛，涉及细胞形态的形成、分化、增值、黏附、迁移和侵袭。大量的研究表明，DDR1 和 DDR2 是多种炎性细胞因子分泌的关键介质 [1-3] ，在多种炎症性疾病中失调，如动脉粥样硬化、骨关节炎、器官纤维化。胶原诱导的 DDR1b 的激活可以显著促进巨噬细胞在炎症反应过程中产生白细胞介素 8( IL-8 )、巨噬细胞炎性蛋白 1α (MIP-1α) 和单核细胞趋化蛋白 1 (MCP-1)。DDR1 敲除的小鼠可以降低脂多糖（LPS）诱导的趋化因子分泌，并使死亡率降低。小分子 DDR1 抑制剂可以减少炎性细胞因子的释放，在小鼠炎症模型中明显的治疗效果。

       研究表明，DDR2 的激活可促进人树突状细胞产生 IL-12、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(INF-γ) 等细胞因子，对炎症性疾病有重要作用。Ⅰ型胶原介导的 DDR2 激活对于纤维化发生至关重要，在早期酒精性肝病模型中，沉默 DDR2 的表达可减少酒精性肝损伤和纤维化。I 型胶原激活 DDR2 可以诱导原代人肺成纤维细胞中 DDR1 的表达，表明这两种受体之间可能存在串扰 [4-5]。因此，DDR1 和DDR2 双靶点抑制剂的开发可能是抗炎药物研发颇有希望的策略。目前已报道了大量的 DDR1 和 DDR2 抑制剂，但大部分化合物选择性差，因此急需寻找选择性好的 DDR1 和 DDDR2 双靶点抑制剂。

      基于这一出发点，作者对课题组前期报道的 DDR1 选择性抑制剂 4（DDR1, IC50：9.7 nM; DDR2,  IC50：175 nM）进行结构改造。（图1）首先，分析化合物 4 与 DDR1 蛋白、DDR2 蛋白的结合模式（图2A-2B），化合物以相似的激酶二型结合模式作用于 DDR1 和DDR2。有意思的是，化合物可以与 DDR1 的 Met704、Glu672、Asp784 残基形成四个氢键，而不能与 DDR2 蛋白中相应的 Met95 形成氢键。此外，DDR2蛋白中的空间位阻使得化合物 4 中的吡唑啉[1,5-a]嘧啶基团与 Tyr94、Met95 残基发生碰撞，进而导致其对 DDR2 的活性较弱。作者通过骨架迁跃的策略，对该基团进行替换，设计了一系列化合物，最终获得化合物 5n不仅具有双重 DDR1 和 DDR2 抑制活性，同时对 Abl1 具有较好的选择性（DDR1,  IC50：9.4 nM; DDR2,  IC50：20.4 nM；Abl1,  IC50：494 nM），其与 DDR1 蛋白的晶体结构复合物揭示了其确切的作用模式（图3）

图1.化合物 4 的结构式及化合物的设计（图片来源：《J. Med. Chem.》）

图2 化合物 4 与 DDR1、DDR2的结合模式预测（图片来源：《J. Med. Chem.》）

图3.化合物 5n 的结构式及其与 DDR1 的共晶结合模式图（图片来源：《J. Med. Chem.》）

     采用 DiscoveRx 方法测得化合物 5n 与 DDR1、DDR2 蛋白的结合常数分别为 7.9 nM 和 8.0 nM。激酶谱实验评价了化合物 5n 对 468 种激酶的影响，化合物的总体选择性较好，但对 Abl1，EPHA2， EPHA7，EPHA8，EPHB2，LCK，LOK，TIE2，TrkA，TrkB 和 TrkC 等靶点的选择性较差，结果如图 4 所示。

图4. 化合物 5n对脱靶激酶的活性（图片来源：《J. Med. Chem.》）

      采用原代人肺成纤维细胞评价化合物对 DDR1 和 DDR2 蛋白活化的影响，Western 结果如图5所示，化合物可以剂量依赖性的降低 DDR1 和 DDR2 的磷酸化，且对总蛋白的量不产生影响。此外，化合物在 50 nM 和 100 nM 对 c-Abl 激酶的磷酸化均不产生影响。

图5.化合物 5n 对 DDR1 和 DDR2 磷酸化的影响

（图片来源：《J. Med. Chem.》）

      由于 DDR1 和 DDR2 是多种炎性细胞因子分泌的关键介质，因此作者分别评价了化合物 5n 在体外和体内的炎症改善效果。首先，化合物 5n 可以降低原发性腹腔巨噬细胞种 LPS 诱导的 IL-6 分泌（图6）。其次，化合物可以改善 LPS 诱导的急性肺损伤小鼠模型中的炎症症状。（图7）

图6.化合物 5n 可以降低原发性腹腔巨噬细胞种 LPS 诱导的 IL-6 分泌

（图片来源：《J. Med. Chem.》）

图7. 化合物 5n可以改善LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型中的炎症症状

（图片来源：《J. Med. Chem.》）

小M 的小思考：

     近年来，人们对 DDRs 蛋白的作用机制及临床意义进行了深入的研究，证明其参与体内多种信号通路的传导和多种生理病理过程。由于其在炎症方面的重要作用，使得其成为开发抗炎药物的重要靶点。本文作者通过分析选择性DDR1 抑制剂在生物学上存在的不足，致力于开发 DDR1 和 DDR2 双靶点抑制剂，并最终获得了化合物 5n，其在体内外均具有较强的抗炎活性。这一研究为寻找强效抗炎活性的候选药物提供了新的思路。

参考文献

[1] Leitinger, B. Discoidin domain receptor functions inphysiologicaland pathological conditions. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 2014, 310, 39−87.

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[3] Li, Y.; Lu, X.; Ren, X.; Ding, K. Small molecule discoidindomain receptorkinase inhibitors and potential medical applications. J. Med.Chem. 2015, 58, 3287−3301.

[4] Yang, J.; Wheeler, S. E.; Velikoff, M.; Kleaveland, K. R.; Lafemina,M. J.; Frank, J. A.; Chapman, H. A.; Christensen, P. J.; Kim, K. K. Activatedalveolar epithelial cells initiate fibrosis through secretion of mesenchymalproteins. Am. J. Pathol. 2013, 183, 1559−1570

[5] Luo, Z.; Liu, H.; Sun, X.; Guo, R.; Cui, R.; Ma, X.; Yan, M. RNAinterference against discoidin domain receptor 2 ameliorates alcoholic liverdisease in rats. PLoS One 2013, 8, No. e55860.

[6] Wang, Z.;Ding, K.;Lu, X et al.Design, Synthesis, and Biological Evaluation of 3 -(Imidazo[1,2.a]pyrazin-3-ylethynyl)-4-isopropyl.N.(3-((4-methylpiperazin-1-yl)methyl)-5(trifluoromethyl)phenyl)benzamide as a Dual Inhibitor of Discoidin DomainReceptors 1 and 2. J. Med.Chem. 

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