CNS文章代码学习（二）Immunity 三级淋巴结构 文章学习

前言：经典的文章值得反复学习，正好也有同学提问figure3的问题；因为我也不是专业的生信研究生，所以只能浅浅讲一讲我的想法和理解。

Summary:

肿瘤内三级淋巴结构TLS的出现与良好的临床预后和对免疫治疗的效果相关。本文使用空间转录组技术研究了RCC中，B细胞在TLS中的作用环境。B细胞富集在TLS中，因此我们可以辨别出所有B细胞到浆细胞（PC）的成熟状态。B细胞受体分析（BCR）揭示了TLS中的克隆多样性，选择性克隆和克隆扩增，并且展示了位于（距离肿瘤中心）远端的成熟克隆型。在TLSs阳性的肿瘤中，产生IgG和IgA的PC伴随着成纤维细胞的轨迹播散到肿瘤床（或者翻译为瘤巢？或者为肿瘤中心？）。TLS+阳性的肿瘤存在高频率（比例）的可以产生IgG的PC细胞以及IgG染色的凋亡的恶性细胞，这说明此处存在活跃的抗肿瘤反应。在接受免疫检查点治疗的RCC患者中，患者对治疗的反应和无进展生存期的长短与IgG染色的肿瘤细胞相关。因此，肿瘤内TLS维持B细胞的成熟和抗体形成，并与对治疗的反应相关，可能直接介导了抗肿瘤效果。

Figure3:

Figure3涉及克隆和BCR分析，与其它figure其实不连贯，先说一下我对这个的想法。

figure3的样本：

既然是BCR分析，那么主要就是3'Spatial BCR profiling和5'bulk RNAseq的BCR profiling。

其中空间的仅限冰冻标本，bulk数据则是有47例。

什么是BCR测序

个人粗浅的理解就是B细胞成熟的过程中要随机突变，其中的某些突变（即克隆型）在癌症免疫中有重要作用，并且大量扩增，BCR就是要找到这些发挥作用并增殖的B细胞克隆型。

其中bulk scRNA-seq spatial的又有些不同

参考链接https://research.medgenome.com/pdf/whitepaper/Bulk_BCR_Technical_White_Paper_May_2020.pdf

Spatial BCR profiling

可以看到这里为了能够有足够的测序深度，达到150000reads/spot，正常情况下75G数据大概是80000reads，可以看到是花了大价钱的。只有这样才能捕获到CDR3的信息。

5'bulk RNAseq

因为VDJ区域距离mRNA的5端更近，所以都是从5'测序。

本文：

通过前述的单细胞结合空间的分析，作者发现TLS同时有正在成熟中的B细胞和已经成熟的浆细胞，所以作者推测在TLS区域中，存在B细胞适应性免疫的形成过程。想要验证这一推理，就需要知道BCR的序列-即需要BCR测序。

随后，这里介绍了一下空间BCR的特殊性，比如高通量，以及通过MixCR技术共找到3015+3084的轻链和325的重链。在TLS阳性的肿瘤中，找到了更多数量的独特的克隆型和总免疫球蛋白count（也就是说有更多的种类和数量）。TLS区域中也发现了更多独有的轻链克隆型。

图AB：

这里出现两个概念，一个是克隆型clonotype,一个是突变mutation。

B cell maturation was evaluated by measuring the mutational counts of V regions of Ig light chain sequences compared withthe mapped V germline gene.

B细胞的成熟与轻链V区的突变数相关，我认为也就是说这里的mutation也可以直接换成maturation。只有拥有很多mutation count的亚型，才是真正扩增发挥重要功能的成熟亚型。

B细胞的成熟过程中，有个很重要的环节是体细胞高频突变：

回顾一下这一过程在B细胞成熟中的作用：

综上，A图和B图的主要意思就在于，TLS中有很多的克隆型，意味着B细胞在此处发生重排，走向成熟，以至于有很多种不同类型的B细胞聚集在TLS区域。但是TLS区域的mutation counts很少，而肿瘤区域中的mutation counts却很高，这是为什么呢？因为真正成为浆细胞的那些克隆型只占所有克隆型的一小部分，但这些浆细胞却产生了大量的扩增，自然也就有了更多的mutation counts。比如TLS中经过重排，有了abcde五种clonotypes，但缺少抗原刺激的它们鲜有扩增，自然也不会有高count。在肿瘤区中，真正发挥作用的clonotype可能只有ab两种，但他们被抗原刺激，发生体细胞高频突变大量扩增，自然就拥有了高count。AB图就是在说明B细胞起源于TLS结构，但是最终到肿瘤区发挥作用。至于B细胞是如何迁移的，这就是后面几张Figure重点介绍的部分，也包括了对成纤维细胞的细致分析。

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C图：

C实际上就是对AB图的统计总结，即两个样本都是肿瘤区域有更高的mutation count

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D图：

ABC都是对空间BCR的分析，D图开始使用bulk的测序数据。

47个bulk样本，根据上文提到的TLSsignature分为high和low组，不管H还是L链，都是TLShigh组有更高的mutation count。原文话是The overall somatic hypermutation level was significantly higher in TLS-high versus TLS-low tumors，这也说明体细胞高频突变就是这里的mutation count。

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E图：

目的：To determine whether somatic hypermutation was accompanied by clonotype selection

图：

利用bulk数据的IgH库：The repertoire of TLS-high samples exhibited both a large number of total clonotype counts as well as a higher proportion of clonotypes counted more than 100 times。也就是说IgH同时有高突变率和高扩增，只有经过阳性选择的克隆型才可能完成扩增。结论就是确实存在克隆选择。

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F图：

目的：To determine the clonal relationships and location of amplified IgH clonotypes。

利用空间BCR测序，引入clonality概念进行评估。

Clonality was defined by the same family of VH genes, identical JH genes and the same CDR3 length and a maximum divergence of 15%in the CDR3 nucleotidic sequences between VH sequences.

方法：使用Levenshtein Distance距离，一般指编辑距离。 编辑距离是针对二个字符串（例如英文字）的差异程度的量化量测，量测方式是看至少需要多少次的处理才能将一个字符串变成另一个字符串。

这里我的理解就是作者把诸多的BCR序列按照一定的方法归为clonality，然后利用Levenshtein Distance计算各个clonality的差异/关系，并聚类。最后得到31个clonal 家族，每个家族下方又有数个members。这些克隆的绝对重复次数和在不同位点的重复次数又各有不同，这说明同一家族的克隆仍然被散播在肿瘤之中。

G图：

在空间图像上进一步验证F图，可以看到一个家族的克隆离得很远，甚至远离TLS

最后作者说空间发现的BCR克隆在5'bulk测序中也有发现，进一步说明了自己结论的准确性

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