组织透明化方法（CUBIC）

备注：只针对性的学习了论文中的组织透明化过程，其余省略。

备注：论文 18 页中，详细介绍了所有试剂的配方
备注：论文 19 - 37 页中，详细介绍了CUBIC管道的组织透明化过程

一、组织透明化CUBIC

• 论文：Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling
• 翻译：先进的 CUBIC 组织透明化技术，适用于全器官细胞分析
• 摘要：组织透明化技术以及通过光片荧光显微镜的高分辨率体成像技术，结合适当的荧光标记，能够提供整个器官中感兴趣细胞的全面信息，如细胞类型，形状，状态和分布情况。特别是组织透明化技术与光片荧光显微镜相结合，是一种用于生物研究和病理诊断的强大工具，可以量化（定量分析）整个器官中的罕见细胞，如干细胞，转移细胞或活化神经元等。此外，推动生物医学研究需要大量的实验和验证，因此，一个简单的高通量且稳定的方案对于促进整个器官的细胞全面分析至关重要。在此，我们描述了一种 CUBIC 组织透明化方法，使用新型高速体成像系统（配备定制的光片荧光显微镜（LSFM））以及高速细胞核检测算法的整个器官细胞分析流程（图1）。

自CUBIC试剂首次报道以来，试剂和方案不断更新，以提高透明度并减少处理时间。
在本方案中，我们描述了两种类型的整个器官透明化程序：
（1）使用CUBIC-L和CUBIC-R+进行快速、高质量器官透明化的方案（图1 步骤4A）；
（2）基于组织膨胀的CUBIC-X方案用于高分辨率成像（图1 步骤4B）
备注：程序适用于任何品系、年龄和性别的整个小鼠大脑。若要将其应用于其他小鼠器官或生物体，用于可能需要对程序进行一些修稿，例如改变试剂体积和浸泡时间。

二、组织透明化的主要方法（疏水、亲水、水凝胶）

为了制备用于体积成像的透明器官，已经报道了三种主要方法：

• 疏水试剂（如BABB、3DISCO、uDISCO、iDISCO）可在几天内获得高透明度的器官。然而，有些有机溶剂需要小心处理，透明化后的器官会缩小，这对高分辨率成像是不利的。
• 水凝胶试剂（如CLARITY）可在一周内获得高透明度器官，但如果没有专用的电泳设备，很难适用于许多样品。此外，据报道，液态丙烯酰胺具有致癌性和毒性。为了克服这些缺点，被动澄清技术（PACT）用于平行处理和无丙烯酰胺方法（如SHIELD20）已经开发出来，该方法使用更安全的柔性聚乙烯代替丙烯酰胺形成水凝胶。使用x射线造影剂、糖或聚乙二醇的亲水性组织清除方法是由Tuchin小组首次描述的，并导致了其他亲水性组织清除方法的发展（例如CUBIC、Scale和SeeDB）。常规生物医学研究中组织清除技术的理想属性是安全、操作简单、可扩展、低环境负担和高透明度。亲水组织清除方法有可能满足所有这些要求。
• 基于亲水试剂的CUBIC试剂已经开发出来。
  • 优点1：优先考虑安全性和减少环境负担，这些方案只需要将样品浸泡在清除介质中，以尽量减少实验程序的数量，并使多个样品易于处理。
  • 优点2：氨基醇能够去除小鼠整个器官和整个身体样本中的内源性血红素。

CUBIC（clear, unobstructed brain imaging cocktails，清晰、无阻碍脑成像混合液）：能够制备高透明度器官，通过浸入 CUBIC 试剂，可在 7-21 天内保留荧光蛋白信号。之后，可以使用高速成像系统（>0.5 TB/h/color）对透明小鼠器官进行成像。此外，为了提高理解能力并简化数据处理，可以在 3-12 小时内从大型图像数据集（2.5-14 TB）中提取器官 (3-12 GB) 中所有检测到的细胞的位置。

三、CUBIC管道的三个主要阶段：组织透明化、成像、图像分析

• 提供了两种透明化方案：
  • （1）使用CUBIC-L和CUBIC-R+的快速高质量方案（步骤4A）
  • （2）使用CUBIC-X的组织膨胀方案，用于高分辨率成像（步骤4B），对成年小鼠大脑而言最多需要21天。

详细步骤：在应用CUBIC技术之前，先对动物进行心脏灌注，灌注液为冷的杜尔贝科磷酸盐缓冲液（D-PBS）和4%多聚甲醛 （PFA）磷酸盐缓冲溶液，然后取出器官后进行固定（步骤1和2）。用PBS清洗残余的PFA（步骤3）后，将固定好的器官用脱脂试剂（CUBIC - L）处理。对于CUBIC-X方案（步骤4B），器官需用CUBIC-X1溶液进行膨胀处理。最后，用CUBIC-R+（步骤4A(vii)）或CUBIC-X2（步骤4B(vii)）调节器官的折射率（RI）。两种方案在脱脂步骤后均可使用适当的核染色剂对细胞核进行染色（表1），这大概需要4天。（步骤五）凝胶包埋：凝胶化前将样本浸入2% 琼脂糖-CUBI 溶液中。

折射率（refractive index，RI）：光线等辐射在一种介质中的速度与在另一种介质中的速度之比。

3.1、组织透明化和凝胶包埋的流程

图2 组织透明化和凝胶包埋的流程。

• a：CUBIC-R+试剂的制备。该试剂可通过温和加热和搅拌轻松溶解。
• b和c：用于组织透明化过程中需要温度控制步骤的振荡培养箱（b）和杂交培养箱（c）；插图显示装有大脑的试管。
• d：2%琼脂糖-CUBIC 溶液的制备。琼脂糖可通过反复使用微波加热和摇晃溶解。
• e：用于脱气步骤的水浴。
• f：脱气步骤后的 2% 琼脂糖-CUBIC 溶液。
• g：凝胶化前将样本浸入2% 琼脂糖-CUBI 溶液中。
• h：用于凝胶化的模具。专为小鼠大脑设计。
• i：凝胶化后的 x-y 视图。比例尺 10 毫米。
• j：凝胶化后的 y-z 视图。比例尺 5 毫米。建议样本顶部和底部留出 1 毫米或更多的余量。
• k：从模具中取出样本凝胶。
• l：将凝胶固定在定制的样本支架上。

备注：所有实验均遵循相关政府和机构关于动物实验的指导方针。

3.2、体成像方法

利用光片荧光显微镜对透明化后的器官进行成像●每个样本所需时间:2-12 小时

关键在于，为了以单细胞分辨率对透明化后的器官进行成像，我们使用了一款定制的光片荧光显微镜(LSFM)，其详细信息将在下文介绍。当然，也可以使用其他成像系统来替代。由于在x-y平面上视野有限，因此引入了拼接方案。例如，经 CUBIC-R+透明化的成年小鼠全脑样本通常在x方向上被分割成 11 至 15 块，在y方向上被分割成 14 至 20 块，且各块之间有足够重叠。每块在z方向上扫描的最大厚度可达 7.5 毫米，每次采集的步长设定为5微米。完成一块的扫描后，视野移动到另一块的位置，然后在z方向上开始扫描。如此重复，直至所有块都扫描完毕。此外，为了在z方向上覆盖整个厚器官，样本需旋转 180°，然后使用与 0°侧相同的拼接方案对样本的另一侧进行成像(图 3d)。采集序列可通过 LabVIEW 和 Visual Studio C# 进行控制。

6. 准备用于显微镜观察的凝胶样本。移除样本表面多余的 CUBIC 试剂后，通过样本夹将样本固定在0台上(图 3b、c)。通常，我们用无绒纸轻轻擦拭样本，然后将其多次浸入折射率调整油混合物中。

7. x-y-z-0 定位。为了使用视野有限且检测物镜工作距离有限的成像系统获取整个器官的图像，我们建议首先进行 x-y 定位。通过改变z位置并搜索 x-y 平面上样本的边缘来确定成像区域的 x-y位置阵列，从而确定x和y方向的起始和结束位置。根据物镜的视野(在此设置中，x=1.40毫米，y=1.66 毫米)确定有效成像区域，并结合适当的重叠值(x轴和y轴均为 130 微米的重叠)计算 x-y 位置阵列。重叠值的设定是为了确保不会遗漏任何样本区域。

关键步骤：为避免信号淬灭，在调整位置和聚焦时必须降低激光功率。例如，我们使用 594纳米激光进行调整时功率为2毫瓦，曝光时间为 500 毫秒，而用于图像采集时功率为 20 毫瓦曝光时间为 20 至 50 毫秒。关键步骤:必须考虑 x-y-z-0 工作台的精度和直线度以确定重叠值。关键步骤:样品的左半部分和右半部分应分别由左照明臂和右照明臂进行照明，以确保照明强度均匀。
关键步骤：必须考虑 x-y-z-0 工作台的精度和直线度以确定重叠值。
关键步骤：样品的左半部分和右半部分应分别由左照明臂和右照明臂进行照明，以确保照明强度均匀。

3.3、细胞核检测算法