SMAD3促进前列腺癌中雄激素受体的表达和活性

雄激素受体（AR）的过表达是去势抵抗性前列腺癌的主要原因，尽管在这种情况下上调AR转录的机制尚不清楚。RNA-seq研究表明，SMAD3的敲低降低了AR和AR靶基因的水平，而SMAD4或SMAD2的敲低影响很小或没有影响。ChIPseq分析表明，SMAD3敲低降低了AR与染色质的整体结合。

在机制上，实验发现SMAD3结合AR基因的内含子3促进AR的表达。CRISPRi靶向这些结合位点降低了AR和AR靶标的转录水平。此外，AR与SMAD3的ChIP-seq峰有50%重叠，SMAD3也可能与AR合作或共激活AR进行AR靶的表达。功能上，AR在SMAD3敲低细胞中的重新表达部分挽救了AR靶的表达和细胞生长缺陷。AR内含子3中的SMAD3峰与前列腺癌数据集中的H3K27ac ChIP-seq和ATAC-seq峰重叠。与原发性前列腺癌相比，AR和SMAD3 mRNA在转移性前列腺癌和CRPC数据集中表达上调。SMAD3 PROTAC抑制剂降低了前列腺癌细胞中的AR, AR-v7和AR靶标的水平。这项研究表明SMAD3可以靶向抑制前列腺癌的AR。

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Enzalutamide（Abmole，M1839，纯度>99%）恩杂鲁胺（MDV3100）是一种雄激素受体（AR）拮抗剂，IC50为36 nM。
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Figure 8. SMAD3 promotes the expression of AR mRNA in human PCa and can be targeted with PROTAC inhibitor.

为了确定AR内含子3中的SMAD3峰是否作为AR基因的增强子，分析了已发表的H3K27乙酰化（H3K27ac）ChIPseq或ATAC-seq数据集，这两个数据集都是增强子标记。AR内含子3中的SMAD3峰与AR阳性PCa细胞（Rv1, VCaP或LNCaP）中的H3K27ac峰重叠，在AR上游增强子（AR基因上游650 kb）中也显示H3K27ac峰（图8A）。

相比之下，AR阴性的PC3细胞在AR内含子3或AR上游增强子中均未显示H3K27ac峰值（图8A）。这些结果支持了AR内含子3中的SMAD3峰可能起到AR基因增强子的作用。接下来，比较了人类PCa样本中AR内含子3增强子和AR上游增强子的相对丰度。在CRPC PDX模型数据集中，8个样本中有8个在AR上游增强子中显示H3K27ac峰值，而8个样本中有6个在AR内含子3增强子中显示H3K27ac峰值（图8B）。在另一个PCa PDX模型数据集中，6个样本中有5个在AR上游增强子中显示ATAC-seq峰，而6个样本中有4个在AR内含子3增强子中显示ATAC-seq峰（图8C）。

因此，这两组PCa样本数据集显示了AR上游增强子和AR内含子3增强子的水平相当。相比之下，其他PCa样本数据集显示了AR上游增强子和AR内含子3增强子的差异水平。一个由22个PCa PDX模型组成的数据集显示，在AR上游增强子中H3K27ac峰的频率（20/22）高于AR内含子3增强子（7/22），而另一个由22个PCa类器官模型组成的数据集显示，在AR内含子3增强子中ATAC-seq峰的频率（12/22）高于AR上游增强子（2/22）。

总之，这些结果支持AR上游增强子和AR内含子3增强子在人类PCa中的重要性。

为了确定SMAD3调控AR表达的生物学意义，分析并关联了人类PCa数据集中SMAD3和AR mRNA的水平。在TCGA PCa数据集中，SMAD3和AR mRNA水平呈正相关（图8D）。

在两个GEO数据集中，与原发PCa相比，转移性PCa（图8E）或CRPC（图8F）中SMAD3和AR mRNA水平升高。接下来，建立了耐enzalutamide的C4-2B PCa细胞系，方法是在逐渐增加enzalutamide剂量的环境中培养C4-2B细胞超过1年。

结果发现，enzalutamide耐药C4-2B细胞中AR和SMAD3的mRNA和蛋白水平高于亲代C4-2B细胞（图8G, H）。在enzalutamide耐药C4-2B细胞中，部分SMAD3 KD达到亲代细胞中所见的水平，部分降低了AR mRNA和蛋白水平（图8G, H）。

结果表明，SMAD3水平的升高可能导致enzalutamide耐药C4-2B细胞中AR水平的升高。总之，这些发现表明SMAD3可能促进人类前列腺癌中AR mRNA的表达，并导致晚期前列腺癌中AR mRNA水平的升高。

PROTAC抑制剂已被开发出来，通过招募VHL泛素连接酶来诱导SMAD3降解（29）。实验在Rv1细胞中测试了SMAD3 PROTAC抑制剂对AR和AR靶点表达的影响。

SMAD3 PROTAC抑制剂降低了Rv1细胞中SMAD3蛋白的水平，同时AR、AR-v7和AR靶标的水平也随之降低（图8I, J）。结果表明SMAD3 PROTAC抑制剂可用于抑制PCa细胞中的AR水平和活性。

鸣谢：Hee-Young Jeon, et al. Nucleic Acids Res. 2023 Feb 2;gkad043.