「数据质控」为什么read中会有5'接头

通常而言测序的时候是不可能会测到5'接头，因为5'接头属于测序引物，我们测序是从5'到3', 整个插入片段测穿了也就是把3'接头测到而已。

测序片段

但在建库过程中其实有一定概率会出现引物自连现象，也就是接头后面连着接头。当我们研究miRNA时，由于miRNA-seq长度只有22 nt左右，而测序P5接头序列长度也是这个范围，那么在胶回收的时候，这种短片段就会一起被回收，自然在后续测序时候也就可能会测到。这就是5' 接头污染现象。

文库构建流程

那么问题来了，这对我们数据分析有什么影响？

我以自己的一批数据作为一个例子，用cutadapt分析在原始序列中一共有多少条read是5'接头污染

RA5=GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC
cutadapt --max-n=0.1 -m 10  -g $RA5 --action=mask -o test.fq.gz test_raw.fq.gz

统计结果

仅有1.3%的原始数据是潜在的5'接头污染，也就是这批数据是合格的，不会影响我的分析。但是如果你的数据中存在大量的5'接头污染，你可以找公司聊聊了。

下一个问题就是如何处理5'污染的接头序列。一种方法，先过滤掉有5'接头的read，然后再用剩余的read进行3' 接头处理。另一种方法，是同时删除5' 和 3' 接头，然后按照长度过滤。

感觉上第一种方法更好些，只是要多写一步流程。我更偏爱第二种，因为高通量数据的量级摆在那里，只要数据整体没有问题，那么这些细节上的改变影响不了最后的结果。而如果你数据本身就很糟糕，那么别指望分析能给的数据带来显著的提高。

参考资料

• https://www.biostars.org/p/138671/