和rna用什么鉴定_RNA纯度很好，但跑qPCR时内参的Ct值却很高?

RNA质量鉴定：纯度、得率、完整性

1、纯度(OD260/OD280)

  OD260/OD280<1.9说明有蛋白污染；

  OD260/OD280=1.9—2.1说明纯度良好；

  OD260/OD280>2.1说明有部分降解。

2、得率(OD260)

  Yeild=OD260x稀释倍数x40ng/ul

3、完整性

完整的RNA电泳条带有3条，但通常会看到28s和18s rRNA，如果RNA没有降解，28sRNA的亮度大约是18srRNA的两倍，也应当可以看到一条由tRNA、5.8S rRNA和5srRNA组成的，该条带较模糊迁移较快。

1%琼脂糖，6V/cm,15min,上样1-3ul

RNA纯度高≠完整性好

上图第6、7、8样品OD260/280分别是1.99、2.0和1.89。但下图电泳结果显示实际上第6、7、8样品RNA已经降解了。此时用降解的RNA跑qPCR就很可能会出现内参的Ct偏高。

核酸电泳就用WIX水平电泳仪

*尺寸大，条带分离的更清晰，效果更好；

*电极架采用卡扣卡紧方式，电泳槽底部无开孔，杜绝漏缓冲液，更换只需要几秒钟；

*电源线采用卡扣卡紧方式，更换方便

WIX水平电泳仪

EB替代物：CelGreen

产品介绍：    

CelGreen是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有独特涉及的荧光染料。在游离状态下侧链、CelGreen发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强,因此CelGreen的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。 

产品优势：

*无毒性：CelGreen 独特的油性和大分子量特点使其不能穿透细胞膜进入细胞内，艾姆斯氏试验结果也表明，CelGreen的诱变性远小于EB。

*灵敏度高：适用于各种大小片段的电泳染色，对核酸迁移的影响小于SYBR Green I。

*稳定性高：适用于使用微波或其它加热方法制备琼脂糖凝胶；室温下在酸或碱缓冲液中极其稳定，耐光性强。

*信噪比高：样品荧光信号强，背景信号低。

*操作简单：在预制胶和电泳过程中染料不降解；而电泳后染色过程也只需  30 分钟且无需脱色或冲洗 ，即可直接用可见光凝胶透射仪观察。

*适用范围广：可选择电泳前染色(胶染法)或电泳后染色(泡染法)；适用于琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳；用于 dsDNA、ssDNA 或 RNA 染色。

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