和rna用什么鉴定_RNA-seq：测序原理之文库构建

在讲测序原理之前，需要有一些最基本的生物知识了解

1）虽然DNA链很长，但是RNA可能比较短，因为有些基因转录了，有些基因没有转录

2）一个DNA上有许多基因片段，每个基因片段的DNA链能转录出一种mRNA，一种mRNA能翻译出一种蛋白质

3）转录时RNA聚合酶一般只转录一个基因

4）每个细胞内RNA可能是不同的，因为不同细胞基因表达情况不同

对转录组测序，我们需要对细胞内转录组的情况有一定的了解。我们带着问题去寻找答案

第一：RNA到底测的什么？

mRNA在生物个体内 RNA的组分中只占很小的一部分，rRNA占绝大多数。一般我们说 RNA-seq指的都是mRNA-seq，后面的流程也都是主要针对mRNA-seq数据分析的。在科 学家们的努力下，可以把那些非编码 RNA提取出来建库，进行测序。 一个成功的 RNA-seq研究，起决定性因素的是一个好的实验设计。还依赖于建库的类型、测 序深度和设置适于的生物重复。并且尽量减少测序本身以外带来的数据误差

第二：文库构建

一般生物体中的的 RNA中，rRNA占绝大多数，含量超过 90%，而mRNA的含量在 1-2%，左右，转录组测序文库是以样本的Total RNA为基础，从中提取mRNA构建测序文库，因此文库构建包括mRNA富集和碎片化、mRNA反转录、接头添加和PCR富集等过程

mRNA富集

在生物的Total RNA中，mRNA所占比例很低，绝大部份时核糖体RNA (rRNA)，因此如果直接使用Total RNA进行测序，得到的结果必然是不准确的，因此需要先将Total RNA中的mRNA分类纯化出来。

转录组测序的文库根据待测样品的物种分为真核转录组和原核转录组。由于真核生物和原核生物mRNA结构不同，因此在mRNA富集时所采用的方法也并不相同。

真核生物mRNA中含有polyA尾结构，因此可以使用oligoT与其特异性的匹配，从而在Total RNA中特异性的富集mRNA。

然而，原核生物并不像真核生物mRNA具有polyA的结构，因此，无法直接利用oligoT将mRNA纯化出来，目前，提高原核生物中mRNA的量，最主要的方式是去除Total RNA中rRNA。

由于测序仪器不能直接对RNA测序，所以还要反转录成cDNA

链特异性文库

由于转录组文库构建过程中要将mRNA反转录为双链的cDNA，因此，在测序时，即会同时得到cDNA双链的序列信息，这就消除了mRNA单链的特性，无法区分cDNA中的正义链和反义链。

因此提出了另一种文库构建方式，链特异性文库，其在文库制备和测序中保留mRNA 的方向信息，使得有效数据增多，基因表达定量更准确；基因注释更准确，新基因识别等分析更可靠；同该方法能够鉴定与开放阅读框反义的ncRNA、发现反义转录本。

其建库原理与普通转录组类似，不同之处在于合成第二链cDNA时，用dUTP代替dTTP，此时第二链cDNA上布满了含dUTP的位点。

在接头连接后用一种特定的酶，其可在尿嘧啶位置产生一个单核苷酸缺口，从而消化掉第二链cDNA，只保留第一链cDNA，随后进行PCR扩增纯化，得到只含第一链cDNA信息的文库。