ChIP-seq基础入门

理解ChIP-Seq

到了目前这个水平，我学习新的高通量数据分析流程时已经不再考虑代码应该如何写的问题了。我更多要去考虑一个技术的目的和意义。

转录组主要研究的问题是基因在不同情况下的差异表达以及RNA结构变化等，而表观组研究的问题是在基因序列不变的情况下，基因的表达、调控和性状发生了可遗传变化的分子机制。也就是相同的DNA, RNA，蛋白质经过一定的修饰后会使得生物性状发生了改变。

Jimmy在生信技能树的论坛上发了一个帖子我对表观的18个疑问, 目前他提出了22个问题，还没有改标题。里面提到的就是ChIP-Seq仅仅是第一个表观遗传学领域比较成熟的技术而已，目前还有很多其他的技术，比如说

• DNA修饰: DNA甲基化免疫共沉淀技术（MeDIP), 目标区域甲基化，全基因组甲基化（WGBS)，氧化-重亚硫酸盐测序（oxBS-Seq), TET辅助重亚硫酸盐测序（TAB-Seq）
• RNA修饰: RNA甲基化免疫共沉淀技术（MeRIP)
• 蛋白质与核酸相互作用： RIP-Seq, ChIP-Seq, CLIP-Seq
• 还有最近比较火的ATAC-Seq ATAC-seq能干啥？

2013年PNAS上面有一篇文章叫做 Epigenetics: Core misconcept 讲了几点关于表观遗传学,大家的理解错误的地方。

本次主要是分析ChIP-Seq的高通量测序结果，因此，先介绍什么是ChIP-Seq.
所谓的ChIP-Seq其实就是把ChIP实验做完得到的DNA不仅仅用来跑胶，还送去高通量测序了。重点在于ChIP，也就是染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation）是用来解决什么科学问题的。毕竟数据分析不是目的，它只是解决问题的一种手段。

ChIP被用来研究细胞内DNA与蛋白质相互作用，具体来说就是确定特定蛋白（如转录因子）是否结合特定基因组区域（如启动子或其它DNA结合位点）——可能定义顺反组。ChIP还被用来确定基因组上与组蛋白修饰相关的特定位点（即组蛋白修饰酶类的靶标） - 来自维基百科。

ChIP的实验我从来没有做过，所以只能从网上找来大致的流程，简单分为
第一步： 将蛋白交联到DNA上。 也就是保证蛋白和DNA能够结合，找到互作位点。
第二步： 通过超声波剪切DNA链。
第三步： 加上附上抗体的磁珠用于免疫沉淀靶蛋白。抗体很重要
第四步： 接触蛋白交联；纯化DNA

实验流程

如果送去测序就是ChIP-Seq, 后续就是对应分析流程，分析分为4步：

• 质量控制， 用到的是FastQC
• 序列比对，Bowtie2或这BWA
• peak calling, 建议用MACS
• peak注释， 推荐Y叔的ChIPseeker

文章中ChIP-Seq解决的问题

这部分看看这篇文章想解决什么问题，以及ChIP-Seq解决了什么问题。工具一定要为目的服务。
PS: 可以先去把数据下载了，再看这个部分

文章的研究内容：
PRC1(Polycomb repressive complex 1)与干细胞命运决定有关。PRC1的组成非常的复杂，原文这样写道：

The protein families that constitute the core of PRC1 contain several members: Cbx (Cbx2, Cbx4, Cbx6, Cbx7, or Cbx8); Ring1A or Ring1B; PHC (PHC1, PHC2, or PHC3); PCGF (PCGF1, PCGF2, PCGF3, PCGF4, PCGF5, or PCGF6); and RYBP or YAF2. Each combination establishes the subtype of PRC1 complexes

文章想解决的问题是：

1. PRC1复合体两类亚型的全基因组定位
2. 两类复合体调节的基因表达是否有差异
3. Cbx7，RYBP是否有共同或独特的生物学功能
4. Cbx7，RYBP在染色质的定位是否是相互依赖

得到的部分答案是：小鼠中有两个互斥的PRC1复合体的变异体，Cbx7和RYBP。Cbx7和RYBP的在基因组上的结合在同一个位置，但是同样互斥，不能共存。 Cbx7用于招募Ring1B结合到染色质，RYBP增加PRC1酶活性。 RYBP所结合的基因，有着较低水平Ring1B和H2AK119ub的水平，表达量高于Cbx7结合态。RYBP和Cbx7的在基因位点的结合情况还与代谢调节，细胞周期过程有关。

ChIP的用途：
为了解决PRC1亚型的定位问题， 作者对PRC1复合体的组成Cbx7, Ring1B, RYBP, 以及PRC2的Suz12f分别做了ChIP-Seq. 然后就是画了很多韦恩图看不同蛋白的靶基因的相互关系。还看了不同蛋白在基因的上的位置。

一般而言，ChIP-Seq基本就是得到上面这些图࿰