SY5Y论文阅读

Modulation of frequency and duration of repetitive magnetic stimulation affects catecholamine levels and tyrosine hydroxylase activity in human neuroblastoma cells: implication for the antidepressant effect of rTMS(以色列理工学院 213名,International Journal of Neuropsychopharmacology,2区)
对强非静态磁场(1-2T)的研究仍然很少,刺激前24小时更换为无血清培养基。1.72T,最大强度的75%。刺激频率为3-45Hz,10s。直径35mm的培养皿刺激细胞。前三天每天刺激3次,第四天刺激两次,最后一次刺激4天后,收割细胞。
高效液相色谱法(HPLC)测儿茶酚胺及其产物的浓度:L-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)、多巴胺(DA)、二羟基苯乙酸(DOPAC)、去甲肾上腺素(NE)。用高效液相色谱电化学检测器检测。SH-SY5Y cells and media were separated on ice and HClO4 was added to a final concentration of 0.1 N.培养基和细胞匀浆离心,脱水、在-70℃保存备用。
络氨酸氢化酶活性检测(Tyrosine hydroxylase (TH) activity):用100μM 3-羟基苄肼(NSD1015)。在测试前用3Hz刺激15min。重复刺激实验中,在最后一次刺激3小时后加入NSD1015 60min.
抑制二羟基苯丙氨酸脱羧酶后测量L-二羟基苯丙氨酸的浓度来反映络氨酸脱氢酶的活性。
蛋白印迹分析:细胞用PBS冲洗,在细胞裂解液里溶解1h(10mM tris、250mM NaCl、5mM EDTA、0.5% Nonidet P-40 and TM protease inhibitors cocktail),离心12000g/5min,取上清液,在电泳负载缓冲液(体积分数:20%丙三醇、4%SDS(W/V)、250 mM Tris–HCl三(羟甲基)氨基甲烷、10%巯基乙醇 0.5mg/ml 溴酚蓝)中稀释1:1,采用SDS丙烯酰胺凝胶(7.5%)分离蛋白质样品转移到硝化纤维素膜上
3Hz 1.7T 10S的单序列刺激,细胞内多巴胺、左旋多巴胺和去甲肾上腺素释放量显著降低,但频率改为9Hz后,显著增加。酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase)在刺激频率为3Hz、9Hz的时候,释放量分别减少和增加了47.8%、48%。这或许是因为络氨酸氢化酶对神经元放电频率和左旋多巴胺敏感。15/20/45等频率的刺激,对儿茶酚胺代谢无影响。3Hz、11序列、4天的刺激对单胺类药物无影响,络氨酸氢化酶活性增加54.5%。总结:磁刺激的频率和时间显著影响儿茶酚胺的代谢!这与抑郁症有关。
培养条件:DMEM+10%FBS+1%双抗+1%谷氨酰胺。施加刺激前24小时,培养基被无血清培养基代替。直接将培养皿放在刺激线圈上。
将SH-SY5Y细胞和培养基在冰上分离,加入HClO4,最终浓度为0.1n。离心(12000 g,4xC),将培养基和细胞匀浆均质物离心(12000 g,4xC),冻干,再悬浮,保存在x70 xC。
色谱分析:用电化学检测器测定儿茶酚胺及其代谢产物:左旋多巴胺(LDOPA)、多巴胺(DA)、二羟苯乙酸(DOPAC)和去甲肾上腺素(NE)的浓度。
络氨酸氢化酶活性检测:用3-羟基苯并肼抑制多巴胺的活性60min后,测量左旋多巴胺的积累浓度,来表征络氨酸氢化酶的活性。
蛋白印记标记:冲洗、离心、稀释、染色、丙烯酰胺凝胶电泳、胭脂红染色、阿默沙姆的电化学发光和XLS Kodak film显示蛋白印迹。
台盼蓝染色测细胞活性,Bradford试剂测蛋白浓度。

Effect of low-and high-frequency repetitive magnetic stimulation on neuroal cell proliferation and growth factor expression:A preliminary report
Ji Yong lee, Hyung Joong(摘要写的比较好Neuroscience Letters 4区 3个月)
材料:小鼠神经母细胞瘤细胞(他们做的小鼠的,我们做人的,他的强度是1T我们可以选择不同强度)在培养皿里养,接种密度2X105cells/cm2,
目的:探究不同频率rTMS对体外培养细胞的影响。(结果:高频利于增殖,低频无效;高频利于蛋白表达,低频抑制)
刺激参数:0.5Hz、1T; 10Hz、1T;每天刺激20min(我们的刺激有wait time,这个貌似没有)
指标:刺激三天(三天换液一次),做蛋白(BDNF、神经胶质细胞营养因子GDNF、neurotrophin-3、血小板生长因子PDGF)印记分析和增殖检测。
关于增殖:刺激四天,刺激强度是100%运动阈值,咋测的?

从第二张图的纵坐标来看,接种密度是2X105/ml

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