大肠杆菌诱导蛋白时OD600=0.6-0.8添加IPTG的思考-实验操作系列-009

一、为什么用OD600表示菌液浓度？

1. 光密度与吸光值的关系

OD600是指在600纳米波长下的光密度（Optical Density），也就是通过细菌悬浮液的光的吸收程度。根据比尔-朗伯定律，光密度与溶液中光学活性物质（如细菌细胞）的浓度成正比。虽然细菌细胞本身不直接吸收光，但它们会散射光线，导致透射光减少。因此，随着细菌数量的增加，OD600值也会增加，从而反映了菌液的浓度。

2. 600纳米波长的选择

• 低背景干扰：在600纳米波长下，常用的培养基（如LB培养基）和微生物细胞成分（如DNA、蛋白质）的吸光度较低，这样就能有效减少背景干扰，确保测量结果的准确性。

• 仪器性能与稳定性：大多数分光光度计在600纳米波长范围内的性能最佳，能够提供更稳定和准确的测量结果。比起其他波长（如500纳米或700纳米），600纳米能更好地避免光散射效应，从而提升测量的准确度。

3. 标准化与可比性

OD600值已成为微生物学领域的标准方法，许多文献和实验标准都使用OD600来表示细菌浓度，这有助于实验室之间的数据对比和实验结果的复现。实验者可以借助已有的文献数据，进行生长曲线的绘制、发酵工艺的优化和菌株筛选等工作，促进了实验的规范化和国际化。

4. 非侵入性与简便性

OD600的测量通常采用分光光度计，操作简单且无需破坏细菌细胞。它是一种非侵入性的实时监测方法，可以高效地用于大规模筛选和反应过程中的菌液浓度监测，方便实验过程的控制。

总的来说，OD600是通过光散射反映细菌浓度的一种简单、快捷且标准化的方式，已广泛应用于微生物学研究中。

二、为什么选择OD600在0.6-0.8时进行诱导？

选择合适的诱导时间点对生物医学研究中的基因表达、蛋白合成及代谢产物积累至关重要。OD600值在0.6-0.8时进行诱导是基于细菌生长曲线的深入理解。

1. 细菌生长曲线的四个阶段

• 迟缓期（Lag Phase）：细菌处于适应阶段，虽然代谢活跃，但种群数量几乎不增加，因此不适合进行诱导。

• 对数生长期（Exponential Phase）：细菌在此阶段以恒定速率分裂，代谢和合成能力最强，是进行诱导的理想时期。

• 稳定期（Stationary Phase）：细菌的增殖速率减慢，代谢能力下降，诱导效果不如对数生长期。

• 衰亡期（Death Phase）：细菌因营养耗尽和废物积累，生理状态较差，不适合诱导。

2. 选择OD600在0.6-0.8时的原因

• 生理状态最佳：此时细菌处于对数生长期的中后期，生理活跃，能够高效响应诱导信号，保证实验成功。

• 稳定性和可重复性：细菌在这一时期的生长状态较为稳定，能够保证实验结果的稳定性。

• 实验优化与效率：此时细菌的生长速度较快，诱导后能迅速进入目标产物的合成阶段，缩短实验周期。

3. 对数生长期中后期的优势

• 代谢活跃与蛋白合成能力：对数生长期是细菌代谢最活跃的阶段，能够高效合成蛋白质，确保蛋白表达的效率。

• 细胞密度适中：细胞数量适中，避免了过高密度导致的代谢压力和营养竞争，确保蛋白合成效率。

总结：诱导时机的选择

• OD600值过低（<0.4）：细胞数量不足，蛋白表达量较低，代谢压力可能影响蛋白合成效率。

• OD600值过高（>1.0）：细胞进入稳定期，代谢活动减慢，蛋白合成能力下降，且可能积累错误折叠的蛋白质。

诱导策略与实验优化

在OD600值为0.6-0.8时加入IPTG进行诱导，能够确保蛋白质的正确折叠并最大化产量。此时，细菌代谢活跃，蛋白合成能力强，能够高效表达目标蛋白，减少错误折叠，提高蛋白溶解性和生物活性。

但实际上，肉眼观察菌多一些较好，怎么都会有蛋白表达不用担心！OD 0.4诱导也有蛋白的，因为表达总是过量的！