phenylalanine ammonia-lyase苯丙氨酸解氨酶PAL功能验证-文献精读61

Molecular cloning and characterization of three phenylalanine ammonia-lyase genes from Schisandra chinensis

五味子中三种苯丙氨酸解氨酶基因的分子克隆及特性分析

摘要

苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化L-苯丙氨酸向反式肉桂酸的转化，是植物和微生物中苯丙烷类生物合成途径中一个重要的关键酶，也是初级代谢与次级代谢之间的连接步骤。五味子（Schisandra chinensis）是一种属于木兰科的木质藤本植物，其二苯并环辛烷木脂素含量丰富，并表现出显著的活性。然而，相较于PAL在木质素和黄酮类物质合成中的功能，PAL在木脂素合成中的功能研究相对有限。因此，克隆和鉴定该珍贵药用植物的PAL基因具有重要意义。在本研究中，我们对五味子中的三种PAL基因（ScPAL1−3）进行了分子克隆和特性分析。通过RACE PCR技术克隆了ScPALs基因，并对三种ScPALs基因的序列进行了基本特征分析，随后进行了分子对接分析。为了确定其催化活性，通过在大肠杆菌（BL21-DE3）中使用pCold-TF载体进行异源表达获得重组蛋白，并通过Ni亲和纯化技术进行纯化。使用反相高效液相色谱（RP-HPLC）与标准化合物对比验证了纯化后的重组蛋白的催化产物。此外，还确定了最适反应温度、pH值及不同金属离子的影响，并在最优条件下测定了Vmax、Kcat和Km值。还测定了三种ScPALs在不同组织中的表达情况。本研究为ScPALs的功能提供了重要的信息。

引言

五味子（Schisandra chinensis (Turcz.) Baill）是一种属于木兰科五味子属的药用藤本植物，主要分布在中国东北地区。五味子的干燥成熟果实被称为五味子，因其具有酸、苦、甜、辛、咸五种味道而得名。五味子一般通过大规模人工栽培生产，其中辽宁省是最重要的主产区。五味子最早记载于《神农本草经》，并被用于治疗慢性咳嗽、遗精、遗尿、慢性腹泻、自汗、盗汗、糖尿病、心悸和失眠等疾病【1】。根据现代化学和药理学研究，二苯并环辛烷木脂素是五味子中主要的有效成分，具有保肝【2】、抗抑郁【3】、抗癌【4】、抗炎【5】、抗溃疡【6】、抗氧化和解毒【7】等多种活性。由于其化学结构和药理作用，二苯并环辛烷木脂素被证明为一种强效的保肝剂，尤其是从其衍生物中筛选出的双环醇，已开发为保肝药物【2】。

二苯并环辛烷木脂素是苯丙烷类化合物的一员，通过苯丙烷途径合成【8】。在该途径中，L-苯丙氨酸首先被苯丙氨酸解氨酶（PAL）脱氨生成反式肉桂酸，随后通过CYP73A（C4H）羟化生成对香豆酸（如图1所示）。接着，对香豆酸通过对香豆酸-CoA连接酶（4CL）生成对香豆酰-CoA，并被C3H和CCoAOMT羟化为阿魏酰-CoA。生成的阿魏酰-CoA通过肉桂酰-CoA还原酶（CCR）和肉桂醇脱氢酶（CAD）转化为松柏醇【9】。经过一系列催化，最终合成二苯并环辛烷木脂素（如图1所示）。已有报道表明，在许多植物和微生物中，PAL是苯丙烷类化合物合成中的关键且限速酶【10】。自Koukol和Conn于1961年在大麦中发现第一个PAL基因以来【11】，越来越多的PAL基因在高等植物中被研究，如鼠尾草【12】、咖啡【13】、罗勒【14】和胡黄连【15】，甚至在一些苔藓植物【16】和真菌【17】中也有发现。在许多植物中，PAL蛋白通常由多基因家族编码【10】。例如，鼠尾草中发现了三种PAL基因【18】，在黑杨【8】和水稻【19】中分别发现了六种PAL基因，而在西瓜中发现了12种PAL基因【20】。

从L-苯丙氨酸酶促生产反式肉桂酸及其在木脂素生物合成中的作用

鉴于其在苯丙素类生物合成途径中的重要性，苯丙氨酸解氨酶（PAL）引起了越来越多的关注。在本研究中，采用cDNA末端快速扩增（RACE）PCR方法，克隆了来自五味子（S. chinensis）的三个PAL基因的全长cDNA序列。对推导出的氨基酸序列进行了生物信息学分析，包括同源性和系统发育关系、氨基酸序列、结构以及物理化学性质。通过分子对接，分析了五味子中三个PAL基因与L-苯丙氨酸的活性位点，并确定了优化的催化条件和催化动力学。同时，通过RT-qPCR评估了三个ScPAL基因在九种组织中的特异性表达。

结果与讨论

ScPAL基因的克隆与多重比对

五味子的三个PAL全长基因被命名为ScPAL1-3。多重序列比对结果表明，推导出的ScPAL1-3蛋白与其他物种的PAL蛋白最大同源性为74.8%，如拟南芥（NP181241.1）、博落回（OVA08384.1）、莲花（XP010261982.1）、罂粟（XP026414499.1）和五桠果树（KAF8393567.1）（图2）。此外，在红色矩形框中展示了三个ScPAL蛋白中一个保守的“GTITASGDLVPLSYIAG”基序（Ala-Ser-Gly）。已知Ala-Ser-Gly（ASG）基序在活性位点残基中有助于底物结合并催化MIO（3,5-二氢-5-亚甲基-4H-咪唑-4-酮）自催化结构域的形成【21】。另一个保守残基“FL”也在黄色矩形框中展示，该残基对PAL酶的底物特异性至关重要【22, 23】。在PAL蛋白中，ASG和FL残基对于以L-苯丙氨酸为唯一底物的消耗起着重要作用。因此，多重序列比对和保守残基分析表明，所有三个ScPAL可能具有催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸的活性。

推导的ScPAL1-3氨基酸序列与其他PAL蛋白的多重比对。参与比对的序列如下：拟南芥（NP181241.1）、博落回（OVA08384.1）、莲花（XP010261982.1）、罂粟（XP026414499.1）、五桠果树（KAF8393567.1）。

蛋白质功能域和理化性质的预测

在推导的ScPALs氨基酸序列的生物信息学分析中，发现这三个ScPAL蛋白与已知功能的PAL蛋白具有高度的序列和结构保守性。InterProscan分析显示，三个ScPAL蛋白结构包含三个功能域，分别是延胡索酸酶/组氨酸酶（IPR024083）、L-天冬氨酸酶样（IPR008948）和苯丙氨酸解氨酶（IPR023144）。此外，分析表明这三个ScPAL蛋白具有将L-苯丙氨酸催化生成反式肉桂酸的活性。我们还在ExPASy网站上分析了这三种蛋白的理化性质，结果显示ScPAL1、ScPAL2和ScPAL3的分子量分别为77.26、84.15和78.61 kDa。这些蛋白的理论等电点（pI）在6.07到6.29之间，稳定性指数（II）在35.76到40.78之间，预计半衰期为30小时，表明推导的ScPALs是稳定的蛋白质。此外，平均亲水性值在−0.113到−0.217之间，表明ScPAL蛋白没有形成跨膜结构（表S1）。

推导的ScPAL蛋白的三维结构分析

为了明确推导的ScPAL蛋白的结构和功能，使用SWISS-MODEL在ExPASy上进行了ScPAL的三维模型比较分析。芹菜（Petroselinum crispum）PAL蛋白（PDB号：1w27）的三维结构被用作模板，并通过SWISS-MODEL（SWISS-MODEL）进行同源建模。通过PDB sum在线工具发现，推导的ScPAL1蛋白由α螺旋（54.69%）、β螺旋（6.57%）、γ转角和无规则线圈（31.19%）以及延展链（7.55%）组成。ScPAL2蛋白由α螺旋（53.65%）、β螺旋（5.93%）、γ转角和无规则线圈（31.40%）以及延展链（9.02%）组成。ScPAL3蛋白由α螺旋（57.36%）、β螺旋（5.83%）、γ转角和无规则线圈（30.00%）以及延展链（6.81%）组成。根据之前关于芹菜PAL蛋白的报道【24】，PAL蛋白的结构被假设为“海马”形状，由前体结合域（4-亚甲基咪唑-5酮；MIO）、核心域和插入屏蔽域组成。对接结果表明，推导的ScPAL1蛋白中有三个氨基酸残基（Gly-114、Asn-261和Asn-385）通过氢键连接；ScPAL2蛋白中有四个氨基酸残基（Asn-264、Tyr-355、Arg-358和Asn-388）通过氢键连接；ScPAL3蛋白中有四个氨基酸残基（Asn-264、Tyr-355、Arg-358和Asn-388）通过氢键连接在L-苯丙氨酸周围（图3）。这些对接结果与模型蛋白与L-苯丙氨酸相互作用的残基相似【24】。总体而言，这些结果表明推导的ScPAL蛋白具有与其他植物物种PAL蛋白类似的功能。

ScPAL1−3与L-苯丙氨酸的分子建模（A1, ScPAL1；A2, ScPAL2；A3, ScPAL3）

ScPAL蛋白的系统发育分析

为了探讨ScPALs与其他PAL蛋白之间的进化关系，使用了其他植物的PAL氨基酸序列，并通过MEGA 7.0程序中的邻接法构建了系统发育树（图4）。在这棵系统发育树中，大多数植物的PAL蛋白被分为四个分支，分别是双子叶植物、单子叶植物、裸子植物和苔藓植物。所有三个ScPAL蛋白聚集在双子叶植物组中。ScPAL1和ScPAL3聚集在一个节点中。在这一亚组中，ScPAL1和ScPAL3与已知功能性PAL基因的黄瓜（Cucumis sativus）的CsPAL具有更近的进化关系【25】。然而，ScPAL2与其他两个ScPAL蛋白的差异较大。

通过MEGA 7软件对S. chinensis和其他植物物种的PAL进行系统发育分析。系统树使用ClustalW比对结果，通过邻接法（neighbor-joining method）和p距离构建。每个内部分支上的数字表示百分比引导值（1000次重复）。

在大肠杆菌中的异源表达及重组ScPAL蛋白的活性

多重序列比对和三维模型分析表明，ScPALs具有与其他植物功能性PAL蛋白高度的序列一致性和结构相似性。为了探索它们的功能活性，将ScPAL基因构建入pColdTF载体中，并在大肠杆菌BL21 (DE3)中异源表达重组蛋白，在16°C、1 mmol·L⁻¹ IPTG的条件下培养24小时，通过Ni亲和层析进行纯化。为了增加重组蛋白的溶解性，在ScPAL的N端融合了TF标签。根据SDS-PAGE分析总粗蛋白，重组ScPAL主要存在于上清液中，分子量（包括48 kDa标签）约为125 kDa（图5A），与理论值一致。在酶活性检测中，ScPALs在保留时间约为24.5分钟处检测到反式肉桂酸的特征峰，该峰在对照组中未被监测到（图5B）。这些结果表明，重组ScPALs是功能性酶，能够将L-苯丙氨酸转化为反式肉桂酸。

ScPAL蛋白的异源表达及酶性质 (A) 三种粗酶和纯化酶的SDS-PAGE分析。M为蛋白质分子量标准；A1−A3分别对应三种粗酶；CON为空载体；a1−a3分别对应三种纯化酶，表示为ScPAL1−3。 (B) 三种ScPAL的酶促反应HPLC色谱图。

酶性质及动力学常数测定

研究了pH值对ScPAL活性（底物为L-苯丙氨酸）的影响，pH范围为3.0至11.0。如图6所示，A1−A3显示，当pH值从3.0升高到8.0时，ScPALs的特异性活性显著增加，而当pH值从9.0到11.0时，活性逐渐下降。所有三种ScPAL在碱性条件下（pH 7−11）的催化活性高于酸性条件下（pH 3−6）。当pH值从6增加到8时，三种ScPAL的催化能力急剧增强；当pH值进一步增加时，催化能力下降。ScPALs的最适pH范围为7.5−8.0，与近期报道的Pseudozyma antarctica的两种PAL的最适pH相同【26】。 同时，研究了金属离子对ScPALs解氨酶活性的影响。如图6所示，B1−B3显示，Cu²⁺、Ag²⁺和Fe²⁺对ScPALs的催化活性具有强抑制作用，而Mn²⁺和Mg²⁺表现出促进作用。这些结果表明，ScPALs的活性受到某些金属离子的影响。 通过使用纯化的重组ScPALs，评估了温度（15−65°C）对催化反应的影响（图6C1−C3）。ScPALs的最适催化温度分别为45°C、45°C和50°C。

ScPALs的酶性质 (A) pH值对重组ScPAL1 (A1)、ScPAL2 (A2)和ScPAL3 (A3)活性的影响。 (B) 金属离子对重组ScPAL1 (B1)、ScPAL2 (B2)和ScPAL3 (B3)活性的影响。 (C) 温度对重组ScPAL1 (C1)、ScPAL2 (C2)和ScPAL3 (C3)活性的影响。数据以平均值 ± 标准差表示（n = 3）。

为了进一步了解ScPALs的催化能力，表1列出了不同植物中已报道的PALs的催化参数。使用L-苯丙氨酸作为底物，研究了ScPAL催化氨消除的动力学特性（图7A1−7A3）。L-苯丙氨酸与ScPAL1（0.17 mmol·L⁻¹）、ScPAL2（0.25 mmol·L⁻¹）和ScPAL3（0.21 mmol·L⁻¹）的Km值与麻黄（Ephedra sinica）中EsPAL1（0.15 mmol·L⁻¹）【27】和肉苁蓉（Cistanche deserticola）中CdPAL1（0.10 mmol·L⁻¹）【28】的Km值相似，高于芹菜（P. crispum）中PsPAL1（0.017 mmol·L⁻¹）【29】和拟南芥（A. thaliana）中AtPAL1（0.068 mmol·L⁻¹）【30】，但低于红豆杉（Taxus chinensis）中TcPAL（1.10 mmol·L⁻¹）【31】和刚竹（Bambusa oldhamii）中BoPAL4（2.07 mmol·L⁻¹）【32】的Km值。

Table 1. The catalytic parameters of PALs in different plants

Plant	Gene name	*K*m/(μmol·L−1)	*V*max/(μmol·mg−1·min−1)	*K*cat/(s−1)	*K*cat/*K*m (s−1·mmol·L−1)	Optimal pH	Optimal *T*	Ref.
Schisandra chinensis	ScPAL1	174.1	0.66	0.85	4.87	8	45	This study
ScPAL2	253.8	0.52	0.67	2.65	7.5	45
ScPAL3	212.6	0.77	0.99	4.65	8	50
Arabidopsis thaliana	AtPAL1	68		1.80	26.47	8.4−9.2	46−48	[30]
AtPAL2	64		3.20	50.00	8.4−8.9	48
AtPAL3	2560		0.10	0.04	8.7−8.9	31
AtPAL4	71		3.00	42.25	8.4−8.8	46−48
Nicotiana tabacum	NtPAL1	59.8		1.09	18.23			[33]
NtPAL2	39.5		1.14	28.86
NtPAL3	36.4		0.78	21.43
NtPAL4	52.4		1.53	29.20
Petroselinum crispum	PsPAL1	17.2						[29]
PsPAL2	16.9
PsPAL3	24.5
PsPAL4	15
Taxus chinensis	TcPAL	1100				7.5–8.0		[31]
Bambusa oldhamii	BoPAL1	230		16.29	70.83			[32]
BoPAL2	993		21.30	21.45
BoPAL4	2072		16.32	7.88
Lycoris radiata	LrPAL3	510				8.5−9.5	35−40	[34]
Cistanche deserticola	CdPAL1	101.3		3.36	33.17	8.5	55	[28]
Ephedra sinica	EsPAL1	152		0.59	3.87			[27]
EsPAL2	144		0.46	3.17
EsPAL3	112		0.36	3.23
EsPAL4	180		0.52	2.87

 

ScPAL1 (A1)、ScPAL2 (A2) 和 ScPAL3 (A3) 的酶动力学 根据米氏方程（Michaelis-Menten equation）计算。数据以平均值 ± 标准差表示，误差条表示三次平行实验的平均值。

ScPALs的组织特异性表达分析

为了检测ScPALs在不同组织中的表达情况，使用RACE PCR克隆了GAPDH基因作为内参基因，并使用基因特异性引物进行qRT-PCR分析（表S2）。在五味子的九种不同组织中，包括叶片、叶柄、茎木质部、茎韧皮部、根木质部、根韧皮部、果皮、果柄和种子，进行了定量PCR分析（图8）。结果表明，ScPAL基因在不同组织中的表达明显不同，每个基因具有其特定的组织表达模式。其中，所有三个PAL基因在茎木质部中的表达量最高，而在果皮中的表达量最低。众所周知，PAL是苯丙素类生物合成途径中的第一个酶，也是合成木质素的第一个酶，PAL在富含木质素的组织中表达最高。ScPAL基因在叶片和叶柄中的表达也较高。在三种ScPAL基因中，ScPAL1在九种组织中的表达量相对较低，ScPAL2和ScPAL3的表达量分别是ScPAL1的2.5倍和2.3倍。

ScPAL1 (A1)、ScPAL2 (A2) 和 ScPAL3 (A3) 在不同组织中的相对表达水平 通过qRT-PCR确定。数据以平均值 ± 标准差（n = 3）表示。

结论

在本研究中，我们对来自五味子（S. chinensis）的三个全长PAL基因进行了分子克隆及其特征分析。通过多重序列比对、三维建模和系统发育树构建，结果表明ScPAL1−3可能具有PAL活性。ScPAL1−3的重组蛋白在大肠杆菌中进行了异源表达并纯化，RP-HPLC鉴定了催化产物，同时研究了温度、pH值和金属离子的影响。最后，确定了ScPAL1−3在不同组织中的转录水平。结果表明，ScPAL1−3能够催化L-苯丙氨酸转化为反式肉桂酸。重组ScPAL的最适温度为45−50°C，最适pH值为7.5−8.0。Cu²⁺、Ag²⁺和Fe²⁺显著抑制了ScPAL的活性，而Mg²⁺则提高了ScPAL的活性。L-苯丙氨酸与ScPAL1的Km值（0.17 mmol·L⁻¹）小于ScPAL2（0.25 mmol·L⁻¹）和ScPAL3（0.21 mmol·L⁻¹）。ScPAL基因在茎木质部中的表达量最高，在果皮中的表达量最低。

五味子（SCF）是一种著名的传统中药材，具有显著的药理活性和广阔的应用前景。然而，目前的研究主要集中在化学成分和药理活性上，关于其生物合成的报道较少。对五味子中PAL的研究不仅有助于进一步理解其生物合成途径，还将为未来该珍贵药用植物的药物和生物技术应用提供基石。

材料与方法

植物材料

植物样本采自辽宁省凤城县，由沈阳药科大学中药学院的贾敬明教授鉴定为五味子（Schisandra chinensis）。植物标本保存在沈阳药科大学中药学院，标本号为P-20200921。采集的植物材料被分为不同的组织组，包括叶片、叶柄、茎木质部、茎韧皮部、根木质部、根韧皮部、果柄、果皮和种子，立即冷冻于液氮中，并储存在−80°C直至使用。

ScPALs和GAPDH的cDNA克隆

根据厂家说明，使用Fruit-mate（Takara, 大连, 中国）和RNAiso Plus（Takara, 大连, 中国）从冷冻组织中提取总RNA。第一链cDNA合成使用PrimeScriptRT Master Mix（Takara, 大连, 中国）进行。ScPAL基因的全长cDNA序列通过SMARTer™ RACE cDNA扩增试剂盒和RACE-PCR方法扩增。然后，5′和3′基因特异性引物（表S2）在来自Gynura bicolor（AB550238.1）、Picrorhiza kurrooa（JQ996410.1）、Sparganium stoloniferum（KF633470.1）和Hevea brasiliensis（KX263324.1）等植物的PAL基因的保守区域设计。PCR产物被亚克隆至pbm16a载体，并转化至DH5α大肠杆菌菌株中，通过菌落PCR筛选阳性克隆，使用FastPure Plasmid Mini Kit（Vazyme, 南京, 中国）提取质粒DNA，随后进行测序（GENEWIZ, 天津, 中国）。基于新序列设计基因特异性引物，扩增ScPAL基因的全长序列，随后构建T载体，进行转化和序列验证。所有引物均使用Primer Premier 5.0软件设计，并将ScPAL1（OK357444）、ScPAL2（OK357443）和ScPAL3（OK357445）的序列提交至GenBank。ScGAPDH基因按照上述程序克隆。其他植物的GAPDH多重序列比对见图S2。引物列于表S2，基因序列提交至GenBank，登录号为OK467969。

ScPALs的测序、系统发育分析及分子建模

ScPAL基因的全长cDNA序列使用ORF Finder工具分析以生成ScPAL蛋白的完整编码区。推导的ScPAL与从NCBI数据库获取的其他PAL序列进行ClustalW多重序列比对。使用MEGA 7.0中的邻接法（NJ）构建系统发育树。通过SWISS-MODEL（SWISS-MODEL）预测ScPALs的三维结构，并使用P. crispum的苯丙氨酸解氨酶（PDB: 1w27）作为模板进行L-苯丙氨酸配体的建模。为了预测ScPALs与L-苯丙氨酸之间的结合位点和结合能量，还使用Schrodinger 11.1程序进行了对接分析。蛋白质结构通过PDBsum程序分析。ScPALs蛋白的理化性质、蛋白质功能位点和疏水性指数通过ProtParam、InterProscan和ProtScale等在线工具进行分析。

ScPALs在大肠杆菌BL21 (DE3)中的异源表达与纯化

ScPALs的编码序列通过同源引物（表S2）扩增后，使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit（南京，Vazyme，中国）插入通过Kpn I和BamH I酶切的pCold-TF表达载体（Novagen, Madison, WI, USA）。通过测序确认阳性重组质粒pCold-TF-ScPALs后，将其转化到大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中进行蛋白表达。转化菌在37°C的LB培养基中培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为1 mmol·L⁻¹的异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达，表达条件为16°C培养24小时。通过在4°C下5000 g离心5分钟收集细胞，重悬于PBS缓冲液（50 mmol·L⁻¹，pH 7.4）后在冰浴中超声裂解5分钟。裂解后的总蛋白进行10% SDS-PAGE电泳并通过考马斯亮蓝R250染色以评估诱导表达的重组蛋白。使用带有6×His标签的Ni亲和层析柱纯化重组ScPAL蛋白。具体操作是用20倍柱体积的PBS平衡1 mL Ni柱（GE Healthcare, Pittsburgh USA），然后上样。使用20倍柱体积的PBS清洗柱子，并用洗脱缓冲液（PBS, 500 mmol·L⁻¹咪唑, pH 7.4）洗脱目标蛋白。通过SDS-PAGE检测纯化蛋白的纯度，并使用Bradford法测定纯化重组蛋白的浓度（Solarbio, 北京, 中国）。

酶活性检测

酶促活性通过修改后的方法【26】进行测定。具体的反应体系包含1 mL 0.01 mol·L⁻¹ PBS（pH 7.5），100 μL粗蛋白提取物和0.02 mol·L⁻¹ L-苯丙氨酸，且粗酶溶液在沸水浴中灭活5分钟作为对照。反应在30°C孵育30分钟后，加入等体积的冰冷乙腈终止反应。反应产物通过0.45 μm孔径的滤膜过滤。使用反相高效液相色谱（Agilent 1260仪器，配有光二极管阵列检测器，Palo Alto, CA, USA）分析反应产物。10 μL样品通过柱层析（C18，5 μm，4.6 mm × 250 mm；Agilent, Palo Alto, CA, USA）进行洗脱，梯度如下：溶剂A为甲醇，溶剂B为0.1%甲酸水溶液：0分钟10% A；30分钟90% A；30-40分钟90% A；40-50分钟10% A。流速为0.8 mL·min⁻¹，检测波长为220 nm。通过与反式肉桂酸和L-苯丙氨酸标准化合物的保留时间进行比较，确认反应产物和底物。

ScPALs的酶性质及动力学常数

通过测量ScPAL在不同温度（15−65°C）下的活性，研究了温度对酶活性的影响。使用三种缓冲体系（50 mmol·L⁻¹柠檬酸-柠檬酸钠pH 3.0−6.0，50 mmol·L⁻¹ PBS pH 6.0−8.0，50 mmol·L⁻¹碳酸钠-氢氧化钠pH 9−11）确定酶活性的最适pH值。为评估金属离子（Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺, Al³⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺, Ag²⁺和Mn²⁺）对ScPAL活性的影响，将ScPAL溶液与这些金属离子（1 mmol·L⁻¹）在4°C下孵育24小时。随后向反应体系中加入终浓度为0.1 mmol·L⁻¹的L-苯丙氨酸。通过使用底物L-苯丙氨酸（0.05−0.5 mmol·L⁻¹）在30°C孵育30分钟，并在290 nm波长下用分光光度计（Varioskan Flash, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA）检测催化产物，测定动力学常数。根据米氏方程（Michaelis-Menten equation）计算Km和Vmax。使用反式肉桂酸的系列稀释液绘制标准曲线，X为浓度，Y为在290 nm处的吸光度，方程为：Y = 5.7614X + 0.0323。在PBS中于30°C孵育30分钟后，测定重组ScPALs催化反应产物的产率。

定量实时PCR（qRT-PCR）

为了分析ScPALs在五味子不同组织中的转录水平，使用Primer5软件设计了每个ScPAL基因的引物。定量引物和用于本研究的内参基因引物列于表S2中。qRT-PCR扩增试验在实时PCR系统（Bio-Rad, CF96）上进行，最终20 μL的反应体系中包含8 μL EvaGreen Master Mix（GENEWIZ, 南京, 中国）、1.5 μL稀释的cDNA、0.25 μmol·L⁻¹的每个引物，最后加入双蒸水。qPCR温度程序为：95°C 5分钟，96°C 15秒，特定引物的退火温度下20秒，72°C 20秒，循环35次。PCR完成后，使用相对转录水平分析法分析结果。每组进行了三次重复实验。