用于即时医疗诊断应用的多重免疫传感器

原文：B. Gil Rosa et al. , "Multiplexed immunosensors for point-of-care diagnostic applications" , Biosensors and Bioelectronics, 203(2022)114050.

DOI: 10.1016/j.bios.2022.114050

译文：

0 摘要

精确、可靠且经济高效的免疫传感器对于疾病进展的早期诊断和监测具有重要的临床意义，而多重传感是下一代诊断学的有前途的策略，这种策略允许同时检测和定量多种生物标志物，具有显著增强的再现性和可靠性，同时与单个测试相比，需要更小的样品体积、更少的材料和更短的单个生物标志物平均分析时间。这篇综述比较了开发多重免疫传感器的不同技术，回顾了使用电学、电化学和光学方法的多重免疫传感器领域的最新方法，概述了阻碍该策略应用于临床的障碍以及可能的解决方案，分享了对多重免疫传感器在未来几年发展的愿景。

关键词：多重免疫传感 即时医疗检测 进行性疾病 蛋白生物标记物

1 介绍

免疫传感器使用抗体作为生物识别元件，将抗体-抗原结合事件转化为可测量的物理信号，这已成为检测低浓度分析物成熟的临床工具。这项技术受益于高度特异性的抗体-抗原结合，是检测一系列生物分子如细菌、病毒、蛋白质生物标志物、核酸、其他小分子的敏感方法。迄今为止，许多免疫传感系统已经被开发用来满足不同临床环境的迫切需要。酶联免疫吸附试验（ELISA）是20世纪70年代开发的最常用的方法（Bange等人，2005；Kadimisetty等人，2015），为蛋白质生物标志物的检测提供了皮克/毫升的灵敏度，但是分析时间长，只能检测单一分析物，并且对于许多新发现的生物标志物的灵敏度低（Li等人，2020）是ELISA的主要限制。从20世纪80年代开始出现了侧向流动免疫传感器（Wang等人，2020），用于即时医疗（POC）检测生物标志物。侧流免疫传感器提供了对单个生物标志物的快速、半定量检测，灵敏度小于每毫升亚纳克，已成为临床筛查中最有前途的方法之一，但是它们不如实验室ELISA灵敏，并且不能提供准确的定量诊断信息，例如生物标记物的浓度（Koczula and Gallotta，2016）。出于这个原因，人们又开发了许多其他商业免疫感测系统，旨在实现快速、成本有效、可靠和高灵敏度的免疫感测，例如Luminex（Wang等人，2005）和Quansys多重ELISA（Rosser等人，2014）。在上一个十年，单分子分析（Simoa）被报导出来，并成为在极低浓度下同时定量多种生物标志物的最先进技术，从亚微微克到每毫升飞克（Rissinet等人，2010），同时，在实验室环境中，采用不同读数改进免疫传感系统的概念验证机制越来越多地被报道，它们主要包括光学（例如，表面等离子共振（SPR）（Petrova等人，2019），表面增强拉曼散射（SERS）（Liu等人，2018a）、荧光显微术（Lee等人，2019），发光检测（Kadimi-setty等人，2018）、吸光度和比色法（Phillips等人，2018））、磁和电（例如，巨磁阻（Gaoet al.，2019），场效应晶体管（Kim等人，2020）），以及电化学传感器（Jirakova等人，2019；Wan等人，2013）。从这些里程碑式的成就可以看出，多重生物传感策略已经成为下一代免疫传感器发展的焦点，图一显示了抗体的分子结构（免疫传感器中的识别受体）、可检测的不同类型的分析物以及免疫传感系统中采用的主要测量方法。

生物标志物及其浓度反映了生物过程并指示相应疾病的存在或严重程度，然而，由于大多数疾病的异质性，大多数有区别的生物标志物的类型和浓度在个体的不同阶段有所不同。这种现象在进行性疾病的患者中尤其明显（Dubois等人，2014），包括神经退行性疾病（Li等人，2020），癌症（Chikkaveeraiahet al.，2012），心脏病（Mohammed and Desmulliez，2011），传染病（Xu等人，2020）和许多其他健康状况（Liet al.，2017）。因此，单独检测一个单一的生物标志物通常不足以提供足够的临床诊断信息或追踪疾病的进展。多重免疫传感器能够同时检测一组不同的生物标志物，这可以从统计学上提高检测的准确性。此外，与分别检测不同的生物标志物相比，多重免疫传感器提供了更高的通量，消耗更少的样品和试剂，需要更少的分析时间，并产生高度可再现的传感信号，如图二所示，尽管它们需要复杂的数学算法来同时分析多种生物标志物和评估信号干扰，但多重免疫传感器的开发对于进行性疾病的诊断和监测仍然是一种有竞争力的方法，尤其是在样本量或资源有限的临床环境中。他们也将促进疾病缓解治疗的发展、预防策略和有效药物的发现。

迄今为止，已经发表了数千篇与“多重免疫传感”相关的文章，但临床上有用的多重免疫传感器的开发仍处于初级阶段，迫切需要进一步开发用于临床环境的多重免疫传感器，并满足对POC测试急剧增长的需求。本综述旨在概述多重免疫传感技术的进展（侧重于空间、时分、频分、条形码和基于粒子的多重技术），揭示每种技术面临的挑战，并总结正在开发的有前途的实验室策略以及如何将其转化为临床实际。我们还简要回顾了多重POC免疫传感器领域，这些领域最近在临床诊断中获得了越来越多的关注，最后我们分享了我们用于进行性疾病诊断的多重免疫传感器发展的未来趋势的展望。

图一 抗体的分子结构（黄色圆圈），其在各种分析物的免疫传感中的应用（绿色圆圈），以及相应的测量方法（蓝色圆圈）。

图二 多重免疫传感器的优势包括更少的样品消耗、更少的单个生物标志物的平均测试时间和材料、更多的信息检测结果和更可靠的统计结论

2 多重生物传感策略

在过去的十年中，多重传感平台得到了广泛报道，总结如下表一所示。这些策略可以分为空间多重、时分多重、频分多重、条形码多重和基于粒子的多重。多路生物传感中使用的主要传感器将生物识别过程中的能量转化为可读信号，包括电学、电化学和光学方法。

表一 根据多重传感器策略、平台类型、总体尺寸、传感器单元数量和性能分类的多重免疫传感器的例子

2.1 空间多重传感器

空间多重是报道最多的多重策略之一，因为这种配置允许检测干扰最小化，并且与大多数测量方法兼容。对于电气测量，检测机制通常基于场效应晶体管（fet），每个单独的晶体管由用特定抗体修饰的导电/半导电通道组成，当相应的抗原结合在传感通道上时，可以调节漏极-源极电流，由此可以确定目标生物标记的浓度（Li等人，2019）。空间电传感器阵列的代表性配置由位于不同空间位置的传感器组成，并且每个传感器可以由用于量化一个特定生物标记的几个电极组成。该领域的早期里程碑工作的一个例子来自Zheng等人，他们开发了一种用于使用硅纳米线检测癌症生物标志物的电多重传感器（Zheng等人，2005）。这些传感器采用FET配置，每个芯片由200个单独的电可寻址传感器组成，如图三a所示，通过将相应的抗体固定在不同的传感器上，实现了同时检测三种癌症生物标志物的高特异性。最近，Kim等人报道了一种基于碳纳米管（CNT）的多重电免疫传感器，用于同时检测阿尔兹海默症生物标记淀粉样蛋白β（Aβ）40、Aβ42、磷酸化tau（p-tau）以及完全tau（t-tau）的可忽略的串扰（Kim等人，2020）.传感器采用密集排列的碳纳米管作为传感材料，传感器阵列分别用Aβ40、Aβ42、p-tau和t-tau的相应抗体进行功能化，如图三b所示。由于传感通道中高度对齐的CNT降低了管与管连接的密度，并确保每个传感器的CNT数量恒定，因此对于相同的临床样品中提出的生物标志物，它显示出对2.20fM、2.13fM、2.72fM和2.45fM的高灵敏度。

对于电化学免疫传感器，可以监测表面电化学电导率的变化，或与抗原抗体直接相关的电活性物质的浓度（Mahato等人，2018）。前一种机制依赖于将抗原结合到用相应抗体修饰的传感器表面上，改变传感器的电化学阻抗，这种变化与结合的抗原浓度成正比。当应用于复杂基质时，该方法的特异性较差，因为电极表面电导率会受到样品种类的非特异性吸附的影响（Contreras-Naranjo and Aguilar，2019），为了改善其性能，该方法通常包括电活性探针（例如亚铁/亚铁氰化钾）以评估免疫识别过程前后的表面可到达性（Khetani等人，2018）。后一种机制本质上是测量电活性物质（Liet al.，2021）或与捕获的抗原相关联（Khetani等人，2018），该配置通常由公共参比电极（RE）、公共反电极（CE）和空间分离的工作电极（WE）阵列（Wilson and Nie，2006a；Zupancc等人，2021），每个WE都可以单独功能化，用于检测不同的生物标志物，同时工作参考电极和工作反电极之间的距离应该保持恒定，以确保测量的可重复性。最新的一个例子是，一个电化学传感器有四个金电极，共用一个伪参考金电极和CE，其组装面积小于7±2.5mm，如图三ｃ所示（Zupancic等人，2021），这样的设计可以同时检测三种不同的败血症生物标志物，由于每个WE之间的空间间隔较大，因此可以消除扩散干扰，以提高传感阵列的精度和准确性。

光学免疫传感器是另一种主要类型的空间免疫传感器。目前实验室中的大多数商业免疫测定使用光学空间读出策略，例如标准ELISA和最先进的Simoa技术，但是这些平台都不能满足POC测试的特定要求（主要是POC测试对便携式测试阅读器的要求）。为了满足这种需求，人们已经致力于开发小型化的基于SPR的空间免疫传感器，一个代表性的平台采用了SPR芯片，该芯片由独立的纳米孔阵列组成，制作在氮化硅基板上，并使用特异性抗体进行选择性功能化，无需细胞裂解或DNA提取即可检测两种细菌菌株，如三ｄ所示（Soler等人，2017），这种平台使用非常好的光传输，这是通过正常的光入射实现的，并且与基于发光二极管（led）和互补金属氧化物半导体（CMOS）的成像器兼容。这使得该设备能够极度小型化，并代表了快速、即时诊断的进一步发展。除了表面等离子体传感器之外，其他多重光学免疫传感器也被并行开发，包括电化学发光传感器（Kadimisetty等人，2018）、化学发光传感器（Xianyu等人，2018），以及表面增强拉曼散射（Banaei等人，2017），这些呈现出多种生物标志物同时检测性能有希望实现。大多数光学免疫传感器，包括商业系统，仍然需要高要求的激光激发和光学信号捕获仪器，这使得它们使用在在临床中基于电的平台更复杂。一个例外是由Tsai等人开发的侧向流动多重比色法，可以用肉眼简单地实现检测。

空间多重生物传感器本质上是一个单个感测单元的重复阵列，因此，其灵敏度、检测限和信噪比在不同单元之间是相同的，这使得空间多重免疫传感器具有内在优势，例如消除串扰干扰并不需要复杂的结构或布局设计，以及易于提高检测通量（多种分析物）。同时它的缺点也是显而易见的，例如集成大量传感器单元的挑战，这需要对每个传感器进行单独的信号采集，以及产生和处理大量传感数据所需的大量时间。通过使用信号多重策略将来自多个传感器的信号组合成一个波形，可以提高传感器的可扩展性，同时减少数据大小和数据处理时间。

图三　空间多重免疫传感器

（ａ）使用硅纳米线检测癌症生物标志物的多路FET传感器设计

（b）用于同时检测Aβ40、Aβ42、p-tau和t-tau的基于CNT的FET免疫传感器

（c）平面电化学传感器由四个单独WE、普通CE、准RE组成，尺寸在7 × 2.5 mm内

（d）用不同抗体修饰的等离子体传感器阵列。每个微流体通道由3个在线传感器阵列组成，其中有两个特定传感器和一个阴性对照

2.2 时分多重传感器

时分多重包括将源自传感器阵列或模块的多个信号组合成单一（扩展的）时间信号。与空间多重相反，每个传感器信号是在固定的时间片段中采集的，然后在时域中与其他信号重叠在一起，通过识别相应的时间段，从最终的组合信号中分离各个传感器信号，因此不需要如图四ａ中所示的并行拓扑结构的多通道采集系统（Mol-derez等人，2021），时分多重可以用单个电子通道来实现，该电子通道结合了多重模拟器，其中来自不同传感器的信号被路由到公共采集通道。这种方法的优点包括，使用了专用于采集不同信道单一信号的较小的阵列面积，与空间多重相比，该阵列面积可以更好的、有效的增加感测元件数量、吞吐量高、元件之间可忽略串扰、系统复杂性降低。然而典型的商用信号多重器件与采集系统的模拟前端相比，有更差的输入阻抗特性，这可能导致传感器本身产生的输出信号的降低（例如信噪比降低），这在源信号（传感器）和多重电子设备之间阻抗不匹配的情况下尤为严重，同时该系统也受到多重器件内部导通电阻和杂散电容的影响，在许多情况下这些是不可忽略的。

另一方面，为了使所有路由的传感器通道提供等效的时间段，数据采集的采样率必须增加，并避免抗混叠效应（奈奎斯特准则）。一般来说，为了保持原始（非多重）采样速率，采样速率必须提高N倍（通道数），由于时分多重不允许并行采集所有通道的信号，因此它被限制在交流（AC）信号（频谱带宽）的低动态范围的应用中，并且不适合检测快速瞬态事件。由于化学过程和反应通常在时间上非常广泛，与由阵列内的不同传感器产生的可接受的信号水平相结合，因此，如果传感器之间的切换过程不干扰进行中的电化学反应，则时分为多重免疫传感器提供了便宜而可靠的解决方案（Liu等人，2018c）。由于时分多重中涉及到简单的电子电路，在过去十年中，文献中已经出现了几种器件，例如用于检测和量化癌症生物标志物的具有不同数量的多重免疫传感器的纸基电化学阵列（Ge等人，2012b），其他生理学相关的代谢生物标记（Zhao等人，2013），通过通用稳压器（采集系统）或集成电流分析多重系统（图四ｂ）用于及时检测具有功能化和可寻址WE的酶（Jichun等人，2005；Yang等人，2009）。时分多重中的最新进展已经发展出了柔性基底上的传感器阵列、用于顺序寻址各个传感器的新方法（体系结构）、多重传感器激活以及通过精确定时控制在同一感测表面上不同生物标记检测技术的组合。

Sankhala等人开发了一种柔性四通道化学阻抗传感器，该传感器制作在聚酰胺基底上，其金电极通过电子束低温蒸发沉积（Sankhala等人，2018），这些传感器旨在测量超低量（1–3μL）的皮质醇，受pH值（4-8）和温度（25-40℃）局部变化影响的汗液样本。培养2小时，传感器的金表面通过二硫代双（琥珀酰亚胺基丙酸酯）连接基进行官能化，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗，并在测量前再次用α-皮质醇抗体培养15分钟。通过以固定测量时间（13ms）的组合序列向每个传感器施加10mV的交流电压（1kHz）来执行EIS测量；施加的电压由集成系统内部的开关矩阵控制，该集成系统配备有基于离散傅立叶变换（DFT）的阻抗分析器。由Sankhala等人提出的基于DFT的时分多重传感器模块利用了响应皮质醇-电极结合的固有阻抗变化，在这种情况下，随着生理pH和温度变化，传感器可以实现稳定的操作，具有7.58%的可变性水平，这是一个相关的表现，因为体内皮质醇的深远系统效应有助于确保体内平衡。在此之后，Wu等人提出了一种用于检测人白细胞介素-6（IL-6）和降钙素原（PCT）的顺序多重方法，该方法借助于电流分析拓扑中的五倍多重生物传感器，其中WE和CE通过将钛和金沉积到Pyrex晶集成来制造，而Ag/AgCl墨水用于构建REs（Wuet等人，2018）。作者还研究了通过单刀/单掷开关实现单芯片恒电位仪接口的不同策略，测量值在传感器之间随时间交替变化，如图四ｃ所示，单刀/单掷开关足以捕捉由携带IL-6或PCT的珠子的较高浓度（LOD估计分别为5.0pg/mL和38pg/mL）引起的在WE上产生的电流曲线的缓慢动态，并且不会出现传感器之间切换产生的电化学反应的明显信号伪影。

在一种不同的方法中，Liang等人开发了一种光可寻址电位传感器系统（ISLAPS），通过离子敏感膜使用硅橡胶作为支撑材料进行生理多参数检测（Liang等人，2021），传感器的四个检测位置（Na+，Ca2+，K+，H+）依次自动照明，同时通过单个硬件通道进行电位计检测，从而获得一个程序控制的时间视觉多重ISLAPS系统，用于在持续1分钟的单个测量框架中检测离子。Na+，Ca2+，K+，H+的平均LOD为6-8ｘ10-6mol/L，5-6ｘ10-6mol/L，4ｘ10-6 mol/L，＜10-9mol/L，这显示出与先前报道的场效应离子传感有着相当的灵敏度，但仍需要较小的样本量并实现三个月以上的长期信号稳定性。Castano-Guerrero等人提出了一种用于癌胚抗原（CEA）的创新双重检测方法，将EIS测量和SERS在同一传感层上的连续时间读数相结合（castano-Guerrero等人，2021），这是通过在改进的丝网印刷电极上抗体结合（第一次孵育）来产生EIS测量（10Hz频率步长和2.5mV振幅），在同一层使用金纳米星和用于SERS的拉曼探针进行第二次抗体结合来实现的，如图四ｄ所示，提出的装置在EIS中显示出CEA从0.25－250ng/mL的线性响应范围，而SERS光谱证实CEA检测在0.025-250ng/mL内。总的来说，这项研究首创了将免疫传感器的EIS和SERS方法结合，通过在同一传感层上连续读数，提高了检测数据的准确性，通过协调培养和测量也易于实施并适用于新的复合设备。

图四　时分多重免疫传感器

（a）用于阳极生物膜的高通量电化学系统，由128个金电极和一个普通铂电极组成

（b）微流控纸基电化学生物传感器，其将多路恒电位仪结构与8个测量通道（示意图）连接，用于检测代谢生物标志物

（c）多路电流分析系统（示意图），具有顺序切换序列，用于测量每个传感器并组合成单一电流信号

（d）具有电化学（EIS）和SERS读数的CEA免疫传感器的顺序组装

2.3 频分多重传感器

在频分多重中，源自多重设备/阵列中的每个传感器信号在频域中被组合，以生成单个信号，从而大大降低了测量数据的量和电子电路的复杂性，然后可以通过多重解调技术（例如快速傅立叶变换和带通滤波）在数字或计算域中恢复原始的单个信号，施加到每个传感器的编码频率信号可以通过信号发生器（如在EIS测量的情况下）从外部施加到设备，或者通过选择性地修改感测基板上的测量电极或相关流体通道的几何形状而在内部施加。使用外部信号发生器需要复杂的信号处理技术来解码单个载频信号，但测量设备比内部方法简单，然而，确保频分多重的内部方法需要先进的微制造技术来调整感测基底或单元的几何形状以生成编码频率正确的图案，因此，应用于纳米孔和纳米通道的生物传感是非常困难的（Liuet al.，2018c）。工程电极的几何形状已经实现在频率多重阻抗传感器中同时检测三个单独的微流体通道，以测量PBS溶液的电阻（Meissner等，2012）。由于几何形状的差异，每个微流体通道（或传感器的子片段）表现出不同的双层电容，由于每个子片段的独特的特定峰值电阻频率（PRF）响应，可以将其建模为三个没有信号重叠的RC电路。其他多重频率编码方案使用节点孔隙感测（NPS）方法，该方法通过细胞穿过它们之间具有不同间距的孔隙而产生（Balakrishnan等人，2013），可精确测量颗粒/细胞尺寸，增加光谱动态范围。在这种情况下，由于可以精确控制后一个参数，几乎不需要交流信号发生器或数据采集系统形式的外部设备，因为编码频率是由通道的几何形状和流速产生的。

然而，文献中发现的大多数频分多重方法仍然依赖于某种外部交流信号的产生，通过同时测量由所述细胞通过平行微流体通道（Coulter装置）在电极上产生的电阻脉冲来检测细胞，从而实现高通量检测（Jagtiani等人，2011），这与目前常用的基于EIS的多重方法不同。如果每个单独的传感器以特定频率测量或具有最佳（特征）频率响应，则可以将源自多个传感器的EIS测量复合成组合信号，在交流刺激方案中，生物标志物的最佳频率本质上与产生阻抗最佳的代表生物标志物与感测基板上的识别元件之间的电相互作用的频率有关，结合扫描宽范围的交流频率（10Hz至103kHz）的电子要求，虽然它不会对单一生物标志物的检测构成很大的挑战，但在单一设备上同时检测多种生物标志物（和其他噪声源）的负担可能会引起诸如信号重叠和类似的频谱谐波等问题。

考虑到这一点，Lin等人使用EIS来检测在多标记平台上共固定的低密度和高密度纯化脂蛋白（LDL和HDL）的最佳频率（Lin等人，2017）。LDL和HDL的电化学响应首先通过将其识别元素（MREs）固定到黄金CEs上分别进行表征，使用扫描频率从1Hz-100kHz的5mV振幅正弦波进行AC测量，在相同的条件下进行两种分析物的共固定，如图五a所示，作者报告了LDL和HDL的最佳频率分别为81.28Hz和5.49Hz，在同一平台上共同固定后，其转换为175.8Hz和5.49Hz。有了这些结果，作者强调了仅使用测量信号的虚阻抗分量而不是复阻抗产生的更宽信号，获得的检测峰的唯一性、更高特异性，其中后面一点在多标记检测中对信号去耦和目标浓度的反算提出了巨大挑战。

图5　频分多重免疫传感器

（a）两种生物标记固定在同一基质上的示意图，记录各自单独的成像阻抗，然后用可辨别的最佳频率检测方法进行信号重叠

（b）用于多重微流体蛋白质生物标志物检测的电极对上的交流EHD诱导的纳米听觉（示意图），具有3个独立的通道和对蛋白质捕获频率的图形影响

（c）磁相关双采样技术，具有巨磁阻（GMR）生物传感器，用于夹层结构中的抗体检测，将磁性纳米颗粒（MNPs）束缚在拟议生物芯片的表面（图）和照集成

（d）用于肿瘤多生物标记免疫测定生物传感器的测试卡的多层结构，具有安装在PCB上的GMR芯片（左）和微通道系统（右）

最后，其他相关方法依赖于使用外部AC刺激来调节纳米剪切力，用于特异性检测血清中的多种蛋白质生物标志物，以及GMR传感器，用于通过磁性纳米颗粒和附着在芯片阵列表面的纳米珠检测肿瘤标志物。Vaidyanathan等人开发了一种多重装置，由图五b所示的100个不对称电极对组成，用于捕获抗体官能化，所述捕获抗体包括：人表皮生长因子受体2（HER2）、前列腺特异性抗原（PSA）和免疫球蛋白（Vaidyanathan等人，2015）。之后，在600Hz-100kHz（Vpp=100 mV）的最佳交流电场影响下，将血清样品同时通过该装置，并且通过色度读数（通过肉眼可检测的颜色变化确定）检测蛋白质。结果表明，所施加的交流频率在捕获水平上的变化是由于功能化电极的双层内的剪切力的操纵（特定的和非特殊的蛋白质结合现象），从而产生了在多重设备中频率信号分离。Kim等人开发了具有集成磁场发生器和基于磁相关的双采样高速采集方法的可扩展GMR生物传感器阵列，以低至6.92ppm的信号电平检测纳米颗粒，从而弥合了频分和基于粒子的多重之间的差距（Kim等人，2018）。如图五c所示，该系统包括具有磁场发生器带状线电感器的GMR传感器阵列，该磁场发生器带状线电感器嵌入在传感器正下方的集成芯片，该传感器对磁性颗粒进行磁化。这会引起传感器可检测到的局部磁场，进而导致极低的毫微微摩尔LOD，低LOD至关重要，因为生物样品很少有磁性。Gao等人进一步开发了GMR多生物标志物免疫传感器以同时检测12种肿瘤标志物，其包括GMR传感器阵列、微流体装置和磁性纳米珠标记，通过双抗体夹心免疫测定（Gao等人，2019）。在图五d中展示的系统通过结合GMR和微流体技术产生了一个非常有竞争力的即时医疗测试平台，通过快速读取时间实现了出色的灵敏度、准确性和稳定性。

2.4 条形码多重传感器

条形码多重免疫传感器是空间多重平台的衍生物，它以可编程的顺序对目标生物标志物或条形码标签进行测量。一种条形码多重免疫传感器是与微流体通道集成在一起的，微流体通道由几个分离的节点样部分组成，每个部分都被一种特异性抗体功能化，该传感器对于检测携带多种表面生物标志物（例如细胞）的颗粒特别有用。其感测机制是，当细胞行进通过微流体通道时，其表面生物标志物与特定节点样部分中的固定抗体相互作用，因此比其他部分更缓慢地移动通过该特定部分，如图图六ａ所示（Balakrishnan等，2015），这导致了条形码状输出信号内的电流脉冲更长，通过分析这些脉冲与对照的持续时间，可以实现表面生物标志物的定性检测。这个基于条形码的电平台可以识别和测量携带目标生物标志物的颗粒的百分比，并且通过添加具有误差校准能力的附加区段，可以容易地增加要测量的生物标志物数量（Wang等，2021）。然而该方法是用来检测携带表面生物标志物颗粒的，在检测细胞内和独立生物标志物方面的能力有限。与空间多重传感器相比，它还要求携带生物标志物的颗粒需要通过所有条形码而不可以被捕获/固定在传感器表面上。除了分析脉冲持续时间之外，已经产生了微电条码作为数字标签，可以在射频（RF）读取器下产生可编程阻抗信号（Wood等，2007）。为了理解工作原理，每个条形码都由具有不同宽度的铝条组成，这些铝条在SU-8层之间被剥离，并用抗体官能化以达到与特定抗原结合的目的。当条形码通过RF读取器时，对于每单位长度，铝带读为“1”，对于每单位长度，铝带之间的空间读“0”。当携带多个生物标志物（多个微条形码）的颗粒通过读取器时，检测信号将明显重叠，这也许是多重生物传感的障碍。尽管使用多个读出电极（Prakash等人，2020）或使用单个电极的正交电阻脉冲感测（Liu等人，2016）（如图六ｂｃ所示）已经改进了该技术，解决了重叠信号的问题，但它的应用仅限于粒子数量和尺寸的检测，其作为一个独立传感器平台的潜力需要进一步探索。

另一方面，光学多重免疫传感器取得了可喜的进展。一个代表性的例子是多重侧流测定（LFA），利用了比色法（Xu等人，2020）、荧光法（Jin等人，2021）或化学发光机制（Roda等人，2021）产生的光信号，这种类似编码条的配置包括暗条形码、白色空间和不可见条形码（印刷在具有特定捕获抗体的白色空间上），彼此之间具有不同的宽度来编码信息（Yang等人，2017），如图六ｄ所示。在注射样品溶液时，所有的生物标记物与它们相应的抗体结合，这些抗体用金纳米颗粒（AuNPs）标记并预先储存在结合物垫中。然后，所有生物标记物按顺序穿过条形码区域，而目标生物标记物则被特定区域上的那些看不见的条形码捕获。不可见条形码中的颜色变化，导致原始条形码宽度变化，这可以显示多种生物标志物的检测结果，如图六ｄ所示。与标准LFA相似，多重LFA的优点包括成本低，可处置性，操作简单和快速检测，但不充分的LOD（毫微克每毫升）限制了它们用于检测临床浓度为每毫升皮克水平的生物标志物，例如大多数血液神经变性生物标志物（Li等人，2020）。

图六　编码多重免疫传感器

（a）用不同抗体功能化的电子条形码多重传感器的示意图。当携带生物标记的粒子穿过微流体通道时，电流脉冲的变化反映了粒子表面上的生物标记和固定的抗体之间的相互作用

（b）和（c）设计正交数字代码，用于对流经聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流体通道的粒子进行电检测

（d）光学条形码多重免疫传感器（LFA）的示意图。Codabar样区域包括深色条形码、白色空格和不可见条形码（特异性捕获抗体），在捕获抗体和AuNPs标记的生物标记物之间结合时，黑色条形码改变它们的宽度，并显示对多个生物标记物的检测

2.5 基于粒子的多重传感器

基于粒子的多重传感器依赖于微/纳米颗粒的亲和力来产生用于检测生物标志物的珠子、聚集体或胶体。由于它们的小尺寸，可以在传感底物上设计许多用于检测的活性位点，而使用特定抗原/抗体的功能化可以导致靶向的多生物标志物识别（表面修饰）。有利于多重生物标志物检测的优点包括，因为比传统电极更多结合位点而产生的更高检测表面体积比，聚集体中某些颗粒的独特磁性而产生的聚合物质之间电子转移增强（更高的特异性），可特异性控制这些颗粒的尺寸分布（Liu等人，2018c）。然而，基于粒子的多重传感器有一些缺点，例如需要先进的微/纳米制造和功能化来生产具有不同孔径的多重传感通道，复杂的传感器结构将导致较低的再现性/稳定性和较高的POC使用成本，颗粒（尤其是金属颗粒）是电不稳定的，这意味着它们可能在生物环境中存在盐的情况下聚集，这种非特定的附着/聚集将减少基于粒子的多重传感器的最终输出和检测问题。因此，在临床样品中使用该方法时，需要进行专用的传感器表面优化，可能导致这一方法的灵敏度和检测范围与在文献中的不一致。此外，需要对颗粒生产和加工进行严格的质量控制，以提高检测的可重复性和可靠性。

尽管如此，由于与抗体特异性结合后胶体结构的大小增加，这种类型的多重传感器以前已用于检测单个集成芯片的粒细胞集落刺激因子以及粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子，在相同的微流控芯片中制造纳米孔以分离具有低通量水平的结构（Carbonaro和Sohn，2005）。它还用于同时检测免疫聚集平台中具有不同大小和磁性的微粒（Han等人，2016b），例如各种浓度的兔抗iGg和人铁蛋白，在进入第二个微型犁刀计数器之前，后者被施加的磁场捕获的磁性颗粒点缀。尽管如此，非特异性附着的发生导致较低的灵敏度和检测极限，这也许可以通过在聚集物表面装饰防污材料来克服。

Jia等人开发了一种用于同时检测CEA和α-甲胎蛋白（AFP）的无标记免疫传感器，使用WEs和石墨烯纳米复合材料的氧化铟锡（ITO）片作为参与抗体-抗原免疫复合物检测的支持基质（Jia等人，2014）。为了避免石墨烯通过苛刻的偶联反应官能化，作者使用聚乙烯亚胺（PEI）官能化的还原氧化石墨烯（rGO）直接负载硫氨酸（Thi）和AuNPs来将CEA固定在ITO上，而普鲁士蓝（PB）和AuNPs用于固定抗AFP。Thi和PB的电流响应的降低是通过抗体-抗原复合物的形成来实现的，该复合物与相应抗原的浓度成正比，CEA和AFP分别产生0.650pg/mL和0.885pg/mL的LOD，在0.01-300mg/mL的线性工作范围内。Wu等人开发了一种基于微粒（MP）的免疫聚集测定法，用于通过诱导PBS和10% FBS溶液中的聚集形成来检测作为模型大分子生物标志物的抗兔iGg和人铁蛋白（Han等人，2014； Wu等人，2015）。抗体（Ab）首先通过链霉亲和素-生物素相互作用与MPs结合，如图七a所示。然后，生物标志物的添加引起Ab-MPs的聚集。聚集可以通过电粒子计数来检测，将生物标志物的不可见纳米级转化为可检测的微米级粒度分布。作者不仅发现aggregates的数量和体积比与生物标志物浓度直接相关，而且还发现可以通过调整Ab-MPs浓度来调整检测范围。反过来，Moral-Vico等人开发了一种微型流动池，用于在基底流和停流方法下使用免疫功能化磁珠（MBs）对髓过氧化物酶（MPO）进行多重计时电流检测（Moral-Vico等人，2015），使用简单的制造工艺（图七b）。这种双重MPO质量和活性测定被应用于十个临床血浆样品的研究，电化学测量是在法拉第笼内使用多电位调节器进行的。作者能够通过适当调整检测和流动条件、MBs、样品磁旋转，达到4pg/mL的LOD（即增强测定动力学，缩短孵育时间，目标生物标记的预浓缩，并与其他样品物种分离）。Liu等人开发了一种使用竞争性免疫聚集和使用微库尔特计数器的连续电压脉冲测量来检测血管内皮生长因子（VEGF）的高灵敏度微流体测定法（Liu等人，2018b），检测原理是，基于靶向细胞分泌体蛋白VEGF和抗生物素包被的微粒与生物素化抗体的特异性结合的竞争，相对于无VEGF样品，减少了用功能化的MPs形成的聚集体的数量，因此功能化MP聚集体的平均体积的减少表明了细胞分泌组的浓度。通过这种方法，作者能够实现与ELISA相接近的VEGF的检测范围（0.01ng/mL至100ng/mL），尽管涉及更容易的样品制备和测量。最后，Zhao等人基于rGO的进展，通过PEI-聚多巴胺（PDA）/rGO纳米复合材料的开发，产生用于检测三种肿瘤标志物（CEA、PSA和AFP）的夹心型多重免疫传感器测定（Zhao等人，2019）。作为传感平台的PDA/rGO同时装载了检测抗体和大量的PEI，以固定不同的信号标记，这大大增加了捕获抗体的负载，并增强了电化学响应信号和在水溶液中的分散。

图七　基于粒子的多重传感器

（a）基于免疫聚集的生物标记测定机制（左），通过微流体电阻脉冲传感器检测（右）

（b）微流控芯片装置组件的图像（左），用于用磁珠（MBs）和抗MPO（右）修饰的过氧化物酶活性的双计时电流检测

作为第二节的摘要，我们提供了表二，该表比较了手稿中讨论的每种多重策略的相关优点和局限性。

表二

3 用于多重免疫传感器的POC平台

迄今为止，大多数临床免疫测定都需要较长的样品输入/处理时间，昂贵的测试试剂盒，侵入性采集过程，要求激光激发和发射捕获仪器，以及经验丰富的人员来操作和维护诊断系统，这些原因限制了它们作为一线诊断工具的可及性和可用性，特别是对于低收入地区和国家的患者（Hampel等人，2018）。为了满足这种需求，结合了高性能生物传感器和低复杂度信号处理系统的POC免疫传感器最近在资源有限的临床环境中开发经济、可靠和快速诊断平台的兴趣，例如全科医生（GP）诊所、药房和疗养院（Sher-idan，2020）。一个实用的POC多重免疫传感器应该满足以下标准：最小侵入性的获取过程和样品体积，从检测中提取的最大信息量，简单的患者干预或操作，从样品到结果的快速周转时间（< 2小时），经济高效的便携式读出系统，足够长的储存和保质期，以及最重要的临床相关性、灵敏度和准确度（Dincer等人，2017）。本节将引导读者了解多重免疫传感器最常用的POC平台（即基于纸张的平台、基于微阵列的平台和基于微流体的芯片实验室平台）的进展，揭示他们的技术挑战，并展望他们在一线临床环境中的潜力。

3.1 基于纸张的平台

LFA是最完善的基于纸的POC平台（包括硝化纤维素膜，尽管它不是纸），其结构简单，快速检测和低生产成本（Li和Macdonald，2016b）。一个早期的例子是商业Triage Cardiac Panel（Quidel以前的Alere），它将LFA的优点与小型化激光荧光系统集成在一起，可以在20分钟内从血浆或全血样品中同时检测多达三种生物标志物（Alghamdi等人，2020）。传感机制类似于图六中讨论的标准LFA，其受益于样品无需功率加载（由毛细管力驱动）和无需专业知识操作。2016年报告了二进制编码的多重LFA，使用单个LFA阵列同时检测7种抗原（Li和Macdonald，2016a），基于纸张的传感通道被分为7个部分，它们被特异性抗体功能化，并能够将比色信息呈现为数字显示。这种新颖的设计允许在无读出设置（肉眼读取）的情况下同时检测理论上多达127个离散分析物。与此同时，探索了其他基于纸张的多重LFA平台，包括多行检测（Noguera等人，2011）、双向检测（Hossain等人，2012）或多方向检测（Peters等人，2015）的策略，但是这些工作仍然是实验室中展开的，在临床环境中使用有限。

多重LFA通常依赖于作为输出的光信号的产生（Taranova等，2015），但是一些最近的方法已经探索了使用电化学检测来提高测试灵敏度（Ruan等，2021）。例如Mao的团队报告了一种多重电化学免疫传感器，该传感器结合了LFA的低成本和快速检测的优势以及AuNP辅助电化学测量的高灵敏度（Mao等人，2008）。该方法采用LFA的基本思想，由纤维素底物上的两个不同抗体功能化的条带组成，抗体捕获其相应的AuNP标记的生物标志物后，将这两个条带切断，并将AuNP溶解在HBr-Br2溶液中，其中可以通过方波伏安法轻松检测金离子（III）。该方法仍然存在LFA的主要缺点，例如一次性条带的重现性低，相对高的样品消耗，以及每次检测都需要对照，并且由于分离检测而有其他附加缺点。

作为基于纤维素纸的免疫传感器有了重大突破，微流体技术已经快速发展以补充LFA（称为基于微流体纸的分析设备或 μ pads）（Lisowski和Zarzycki，2013）。该技术不仅显示出高度的多重传感能力和改进的感测性能，而且还实现了样品操作功能，例如液体混合、分裂（Abadian等人，2017）和生物样品过滤（Pollock等人，2012）。例如Ge等人演示了用于四种生物标志物的电化学发光检测的3D多重 μ pad（Ge等人，2012a），该 μ pad平台允许液体样品在所有方向上流动，并且可以将一个单个样品分布到数百个感测点，使得更多的感测装置能够集成在有限的面积内（Martinez等人，2008）。在这项工作中，三个电极（工作、计数器和参考）用预先印刷的蜡微流体储存在丝网印刷纸上，八个工作电极用四种特异性抗体进行功能化，图八ａ所示，加入样品溶液和Ru（bpy）32＋-分子信号抗体后，Ru（bpy）32＋-三正丙胺（TPA）电化学发光被用于检测所有四种肿瘤生物标志物。与标准LFA相比，μ pads尚未广泛商业化用于POC诊断应用，这可能是由于生产成本增加，生产机制的复杂性（许多步骤），半定量的敏感性，再现性不足（由于基于织物的结构的性质及其与复杂生物样品的相互作用），操作复杂性（例如，液体注射，控制和读数之间的无仪器比较）。尽管已经努力组合手机或便携式扫描仪以提高便携性（Lim等人，2019），但是 μ pad，尤其是与多重免疫传感相关的，还需要进一步开发。

图八　纸基多重免疫传感器

（a）用于四种生物标志物的电化学发光检测的3D多重μpad。微流体（作为储存器）首先被蜡图案化，并且电极被丝网印刷在基于纸的基底上

（ｂ）通过用嵌入的电触点将纸A和B夹在板A和板B之间而形成的POC平台

3.2 基于微阵列的平台

基于微阵列的平台基本上采用基于空间或粒子的多重传感策略来同时检测多种生物标志物。作为临床诊断中最成熟和标准的技术之一，高通量多重微阵列可以使用喷墨印刷容易地绘制在显微镜载玻片上，分辨率低至每点亚皮升。信号读出（检测）可通过第二节讨论的光学方法实现（Chenet等人，2018），通过扫描电荷耦合器件或CMOS照相机来测量激光诱导荧光的强度（Chandra等人，2011）或化学发光（Kadimisetty等人，2015），如图九ａ所示。一个优秀的产品是Simoa平台，它已成为实验室环境中量化低浓度生物标志物的金标准，通过对分布在空间的孔中的50万个微珠（每个孔一个微珠）进行数字计数，并用多达四种不同的捕获抗体（和荧光标记）进行标记，这种多重技术在临床体液样品中提供了10fg/mL水平范围内的LOD（Lee et等人，2020；Norman等人，2020），如图九ｂ所示。尽管大多数基于微阵列的系统都需要大量的激光激发和信号捕获，但也有一些小型化系统，例如Hedde等人开发了基于3D打印的低成本便携式平台，该平台可以部署到一线临床环境中，用于检测来自包括SARS-CoV-2在内的10种呼吸道传染性病毒的23株的67种抗原的血液抗体（Hedde等人，2020）。光学测量也可以在金属传感器表面上使用SPR技术以无标签的方式进行，通过创建斑点大小为200至750微米的基于SPR的抗体微阵列，同时检测浓度为1-300nm的β2-微球蛋白和胱抑素C（Lee等，2006），但是该方法的复杂性和成本需要进一步优化，以使其在诊断应用中实际有用。

图九　基于微阵列的多重免疫传感器

（a）对于光学微阵列，首先将液体样品绘制在基底上，然后记录图像或光学信号，其中光学信号的强度通常与相应抗体的浓度成比例

（b）检测IgG、IgM和IgA抗体的Simoa技术示意图。S1: S1亚单位；RBD:受体结合域；SβG:链霉亲和素-β-半乳糖苷酶

（c）用于同时检测信号转导子和转录激活子3（STAT3）、胞质分裂8（DOCK8）或磷酸葡萄糖变位酶3（PGM3）蛋白的基于电化学微阵列的免疫传感器的示意图

还可以通过具有可单独寻址的微电极的电化学方法来实现微阵列的读出，最直接的配置由单个微电极的阵列以及共享的参考电极和反电极组成（Cooper等人，2010）。Eissa等人成功地展示了一种基于微阵列的免疫传感器，用于同时检测三种免疫缺陷性疾病生物标志物，其LOD低至几微克/毫升（Eissa等人，2018），如图九ｃ所示，这与最先进的Simoa技术相当。简单地通过替换工作电极表面上的相应材料捕获抗体，该平台还证明了其检测冠状病毒（Layqah和Eissa，2019）和多达七个肿瘤生物标志物（Wilson和Nie，2006b； Wu等人，2007）的潜力。该方法中的电极材料，例如石墨烯或AuNPs（Li等人2015，2020），可以有效提高免疫传感器的灵敏度，但这种电极材料通常也会增加传感器的复杂性并降低再现性，因此必须仔细平衡免疫传感器的灵敏度和复杂性。与基于纸张的平台相比，基于微阵列的平台可确保对多种生物标志物进行快速且高通量的检测，使用固态基板和CMOS制造代替纸张平台的方法可显着提高多重单元的集成度，并提高检测的再现性和灵敏度。但是，在将微阵列部署为临床上有用的POC平台之前，需要解决包括相对较高的样品量消耗，复杂的底物预处理（例如，使用喷墨打印机绘制样品），体积庞大的仪器（尤其是用于光学检测方法），缺乏样品制备功能（例如，干扰物分离，目标生物标志物富集），传感器表面上的液体样品在尺寸、形状、流动方向和不同点之间的串扰方面保持不受引导和不受控制等的问题，进一步提高多重单元的集成水平、多功能、灵敏度和可重复性的能力以及非专业人员的易用性。

3.3 基于微流体的芯片实验室平台

高度集成的微阵列平台与快速发展的微流体处理技术的结合极大地拓展了多重POC免疫传感器的界限，这种基于微流体的芯片实验室平台主要采用基于空间和粒子的多重传感器策略，由光刻胶、PDMS或其他聚合物制成的微流体（串联或并联）组成，其使用各种入口或阀将液体样品精确地转移至检测或处理点（benge等，2005）。

微流体装置的最简单和最常用的功能是将液体样品引导到特定的传感阵列，如图十a 所示，这样的免疫传感器可以通过单个通道引导血浆样品在石墨烯FET阵列上垂直流动，其中每个装置被不同的抗体官能化以用于多重传感（Park等人，2020）。在抗体与其特异性生物标志物之间结合时，可以通过监测电阻的变化或狄拉克位移来实现检测（Ramadan等，2021）。更高级的电气配置可以包括通道网络（2-4个通道）、致动阀以及用于每个通道的多个入口和出口，例如Liu的团队开发了具有两个平行通道和感测区域的免疫传感器平台，用于同时检测沙门氏菌血清型B和D（Liu等，2019）。尽管微流体的这种配置可以进一步集成用于与更先进的制造技术（Thorsen等人，2002）的高级多重传感，但由于其传感器复杂性、庞大的气动控制系统和复杂的流体连接，它不还不能成为当前的主流POC诊断应用。

微流控技术与电化学免疫传感器的结合比与电学方法的结合更频繁，根据标记粒子的数量和多重传感器策略，这些平台可以分为许多子类型。例如，可以在单个微流体通道中使用不同的氧化还原粒子来实现多种生物标志物的检测（Zhou等人，2010），但它的多重检测能力通常受限于一个检测过程中可以使用的粒子数量。多重检测也可以使用单个微流体通道中的单个标记来实现，Yang和Otieno分别报告了他们的基于微流控技术的生物标记物多重检测平台（Otieno等人，2016；Yang等人，2014），他们使用了一系列印刷的工作电极，这些电极已经用相应的抗体功能化，可以在密封的微流体通道中单独寻址这些平台，如图十b所示。HRP是用于标记这种构型中的所有检测器抗体最常用的酶之一（serafín等，2020），该方法可同时检测多种生物标志物。此外，可以以无标记的方式进行多重电化学免疫检测，其中检测机制依赖于修饰电极表面的电化学响应的变化（Cotchim等人，2020），而不是酶或氧化还原标签

像电免疫传感器一样，当需要在微流体中同时检测多种生物标记时，优选在空间上分离每个感测单元，以减少由不可避免的横向液体运动引起的串扰，并避免随着更长的流动轨迹而导致的目标浓度降低，这对于高度集成的设备特别重要（Wilson and Nie，2006b）。最近的一个例子介绍了用于同时检测三种不同病毒的微流控系统（Han等人，2016a），由一个单一的样品入口组成，然后分成三个平行的通道，其中嵌入了各自的免疫传感器，每个装置都有自己的工作电极、反电极和参比电极，它们在空间上是分开的，以避免任何串扰。

基于微流体的多重传感器也可以与光学免疫传感器集成。荧光检测是主要的多重光学免疫传感器类型，具有用作POC诊断装置的潜力，因为检测可以使用成本有效且小型化的光电二极管来实现。Soares等人报道了一种新型的多路微流体免疫传感器，如图十c所示，该传感器由四个具有固定微珠的微流体通道、一个用于样品注入的主微流体通道和耦合光电二极管荧光信号采集阵列组成（Soares等人，2018），前三个腔室中的珠子用三种不同的抗体对其相应的靶标进行功能化，而第四通道中的珠子用抗牛血清白蛋白（BSA）抗体修饰以提供最大信号水平（作为阴性对照）。当样品和真菌毒素-BSA-Alexa 430复合物串联流过四个通道时，目标生物标志物与复合物竞争结合固定化珠子上的抗体。样品中的生物标志物浓度越高，便携式读出系统检测到的荧光信号越低。除了这项工作，还使用不同的方法创建了其他微流体光学POC平台，例如化学发光（Mou等人，2019）和SPR（Tokel等人，2015）.使用其他光学方法，如电化学发光（Kadimisetty等人，2018），磁珠辅助检测（Gao等人，2019），SERS检测（Gaoet al.，2018），或者局部表面等离子体共振（Yavas等人，2018）。但这些设备庞大的光学设置和复杂性降低了它们作为POC设备转化为临床设置的能力和容易程度。

图十　基于微流控芯片实验室的多重免疫传感器

（a）具有穿过感测阵列的单个导向微流体通道的多重电免疫传感器的分解图

（b）Top:微流控免疫传感器，包含PDMS层中的所有试剂，用于同时检测四种生物标志物

（c）与便携式读出平台串联的用于检测三种生物标志物的基于多重微流体的荧光竞争性免疫传感器

更重要的是，微流控技术赋予免疫传感器专用的样品处理和操作功能，以实现完全集成的芯片实验室平台。这使得能够检测高粘度、多组分、具有复杂基质的生物样品，例如全血。这将消除对样品制备的要求，促进临床转化的进程，例如Gao等人开发了无源微流体收集器，以实现有效的伤口流体收集（图十一ａ）。收集器由一排半开的锯齿形毛细管组成，以引导体液流向传感器（Gaoet等人，2021）。生物样品处理的另一个重要功能是分离干扰颗粒，这通常是常规临床化验的第一步，即从全血中分离血浆，这需要专用的离心机和实验室环境中的专业操作。或者，Zweifach-Fung效应可与交叉流和流体动力流方法一起用于微流体中，用于从手指穿刺血液中同时分离血浆、红细胞（RBC）和白细胞（WBC），如图十一ｂ，其分离机制是，当全血遇到微流体通道中的分支时，较大的颗粒优选以较高的流速进入通道，而较小的颗粒（或液体）以较低的流速集中在通道中。除了液体收集和分离之外，微流体技术还可以帮助萃取、流体混合和纯化，详见Nge等人，（2013），这些平台可以极大地促进资源有限的环境或POC环境中的生物样本分析。总之，微流体在多路POC免疫传感器中的作用包括控制流动条件、减少样品体积、提高试剂混合速率、提高检测灵敏度，以及将多种样品制备功能集成到完整的芯片实验室平台。

图十一　具有样品处理和操作功能的微流体

（a）与多重电化学免疫传感器集成的定向微流体伤口渗出物收集器

（b）血液成分分离微流体装置的示意图。该装置可以通过单个装置同时分离血浆、红细胞和白细胞

4 结论与展望

自从多重生物传感概念的出现，许多商业产品和原型平台开始使用不同的多重传感策略和传感平台，它们有各自的优点和缺点，其中一些如Simoa和邻近延伸试验，最近甚至成为新一代的金标准实验室试验。他们已经从临床样本的初步研究中提供了有希望的结果，并且也开始显示出对临床诊断以及生物标记检测的重大影响，但这些平台目前都不能作为POC诊断工具部署。

这导致了对多重POC免疫传感器的迫切需求，这种传感器应该低成本生产，并且为样本较少的用户提供高灵敏度、快速读出时间和低系统复杂性。为了满足这种需求，人们提出了不同的策略来开发多重免疫传感器，主要包括空分多重、时分多重、频分多重、条形码多重和基于粒子的多重传感器，为了使这些策略被实际用于POC诊断，基于纸、基于微阵列和基于微流体的芯集成实验室平台被并行开发出来，尽管初步结果已在实验室中得到证实，但这些多重免疫传感器的进一步转化和商业化仍面临许多挑战，因为它们中的大多数仍处于早期开发阶段（缺乏临床结果），受限于它们的多重检测能力（只能同时检测到少量的目标生物标志物），或者受到高系统复杂性的限制（基于微阵列或微珠的平台）。在这个背景下，应在其他功能组件（例如，血液过滤或液体处理）方面投入大量精力，以最大限度地减少用户干预。此外，目前的成果大多集中在传感平台硬件上，还需要进一步开发和优化复合信号的多重算法，以处理矩阵效应，应对患者之间的差异。总之，复合免疫传感器的未来发展方向将是系统组件的标准化和小型化，以及作为即用型应用的高度智能化开发。