【生物信息学学习】生物信息学学什么？

生物信息学实验要做什么？

转录组学：研究RNA表达
基因组：构建一个物种的基因组
比较基因组：物种之间的比较
重测序与群体遗传
R语言与生物信息绘图

生物信息学包含：
转录组、基因组、重测序等等等

一、入门：转录组分析

为什么学习转录组分析？
答：简单且易于理解

DNA-RNA-蛋白

1. 转录组分析流程

1. 标准分析
   标准分析中需要对测序数据进行处理，数据量大多上百G，因此普通的电脑难以进行处理。多租借服务器或构件Linux进行处理。
2. 表达矩阵
   对数据进行初步分析后可以得到表达矩阵，该矩阵的数据量不大，大多只有几M的大小。
3. 个性化分析
   前两步的数据均采用标准化的方式进行，而个性化分析多根据自身需求，采取R语言进行数据挖掘，最终得到一个统计表格。

2. Linux vs Python vs R

R语言：主要适用于数据的可视化与数据绘图，其最大优势是贴合生物信息学的需求。
Bioconductor：R语言社区，可以下载插件进行使用。
Python：在机器学习方面更强。

3. 学习计划

1. 第一天：测序原理学习
2. 第二天：Linux基础
3. 第三天：生物信息软件安装
4. 第四天：测序实验入门
5. 第五天：转录组基本原理与方案设计
6. 第六天：数据预处理
7. 第七天：将测序数据对比到参考基因组
8. 第八天：表达定量与标准化
9. 第九天：功能注释与整理基因信息表
10. 第十天：R语言基础
11. 第十一天：Tidyverse
12. 第十二天：样本相关性分析、聚类分析、主程序分析
13. 第十三天：差异表达分析
14. 第十四天：差异基因的富集分析

二、测序原理

1. 测序技术发展时间线

1970年代：人类基因组计划启动，测序技术仍处于起步阶段，只能测定数百个碱基。

1980年代：Sanger测序法被广泛使用，可以测定数千个碱基序列，但仍需要大量的试剂和手工操作。

1990年代：自动测序仪出现，大大提高了测序效率和准确性。

2000年代：大规模并行测序技术的出现，如Illumina测序，使得测序速度和覆盖面积大大提高，成本大幅降低。

2010年代：单分子测序技术的出现，如PacBio测序和Oxford Nanopore测序，实现了实时监测和长读长测序，为基因组学和微生物学等领域的研究提供了强有力的工具。

2. illmina测序原理：边合成边测序，类似于PCR

illmina存在的问题：

1. 如何区分不同碱基？答：对dNTP进行荧光标记
2. 荧光太微弱怎么办？答：桥式PCR扩增成cluster，同时合成
3. 合成太快来不及识别？答：末段终止法，暂停合成

测序步骤：
1、DNA通过超声波等方式进行随机打断
2、固定长度DNA进行选择，在载玻片的接头上进行桥式PCR连接
(如何选择固定长度？答：切胶回收)

3、合成完变为双链，每个模版链打开变成新桥
4、形成DNA簇（方阵），切割、保留同一顺序方向的DNA链
5、每合成一个碱基叫一个cycle，每次进行检测

相关概念：
鸟枪法：测序是随机抽样的过程，需要增加测序的深度。测序时并不知道如何测序，每个基因组的位置均被覆盖多次（例：人的基因组3G，可能需要30G来进行测序，平均每一片段可能可以覆盖十次）

其上有八条lane，一条lane可以产生130G数据。
lane上的y型接头：illmina试剂盒上有不同的y型接头，上有不同barcode
不同的barcode可以在一条lane里检测多种基因数据

（1）Fastq数据格式

最为重要的数据：第二行、第四行

碱基质量体系

公式：Q=-10log10e

例子：Q30>80%的含义？公司承诺10G中有8G错误率小于1/1000

质量值为表示方便采用ASCII码表示：sanger = Q+33
用sanger的值对照ASCII表进行查询

补充概念：
Sanger是一种DNA测序技术，也称为“链终止法测序”，是由英国生物学家弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）在1970年发明的。这种技术通过使用不同大小的DNA段和DNA聚合酶来合成DNA链，同时在合成过程中添加由四个不同荧光染料标记的特殊核苷酸，当DNA链合成结束时，就会形成一系列不同长度的DNA片段，这些片段可以通过电泳分离并读取其中的荧光基团，从而确定其序列。Sanger技术是DNA测序领域的重要里程碑，为许多生物学和医学研究提供了基础和方法

（2）名词解释

1. Read：DNA片段双模端测序中，测出来的一个序列叫一个Read
2. Read length：测出的序列长度

双模端测序：
双模端测序是一种基于Illumina（意为"照亮"）测序技术的高通量测序方法。它使用两个不同的寡核苷酸适配物来同时测序DNA或RNA的两端。这种方法可以提供两个方向的序列信息，从而在基因组或转录组的拼接、注释和分析中提供更全面的信息。
在双模端测序中，DNA或RNA样本首先被随机段切割成小片段，然后被连接到两个不同的适配物上。这两个适配物包含不同的序列，以便区分两端的序列信息。接着，这些适配物会被PCR扩增，生成大量的复制品。最终，这些片段会被连续地读取，生成两端的序列信息。
双模端测序能够减少拼接时的歧义和增加转录本的可靠性，但也会增加数据量和测序成本。因此，研究人员需要权衡测序深度和实验成本，以选择适当的测序策略。

3. Insert size：DNA片段的长度
4. Single end/ paired-end：单模端测序/双模端测序（多用于凑lane需求）
5. Depth（测序深度）：染色体的某一个位置被多少DNA片段覆盖
6. Coverage（覆盖度）：测试多次后，有百分之多少的基因被覆盖
7. Tile / lane / flowcell ：虚拟概念/波片上的栅格/核心波片
8. Adapter：接头
9. Index/barcode：六个序列用于区分不同样本
10. base calling：用照片翻译成ATCG碱基

3. PacBio测序原理：边合成边测序（一般不用于转录组测序）

核心技术：零模波导孔（ZMW）。底座射出激光，若不合成，则荧光信号弱；若合成，则强烈被检荧光信号。

PacBio解决边合成边测序难点的方法：
在小孔中合成，减少背景噪音（illumine因为在空旷场所，所以背景噪音大）

PicBio两种模式

1. PacBio CLR（多次在哑铃型接头上结合，多圈结合）
   PicBio在两端添加哑铃型接头（illumina是y型接头），用于多次测试基因片段，以提高准确率。
2. PacBio HiFi
   更先进、准确性更高

1k = 1000 bp
1M = 10^6 bp
1G = 10^9 bp
1T = 10^12 bp

三、测序技术运用

1. 序列的拼接（高通量测序技术，降低成本）
2. 重测序（不必测过长的基因）
3. 丰度估计：拷贝数变异、三体综合征等